¿Qué método químico se utiliza para detectar si hay priones en el alimento del ganado?
1 experimento de transmisión animal
El experimento con animales es el medio principal para determinar si un organismo está infectado con priones, determinar el título de infección y estudiar priones. infectividad. Con el desarrollo de la tecnología de detección, muchas funciones de los experimentos con animales han sido reemplazadas por métodos más rápidos y precisos, pero como método biológico, sigue siendo un eslabón indispensable e importante en la investigación de priones. Actualmente, se han establecido modelos de infección animal para la mayoría de las enfermedades priónicas conocidas, siendo los ratones, las ratas y los hámsteres los animales experimentales de priones más utilizados.
El método convencional consiste en utilizar una varilla trituradora de politetrafluoroetileno para homogeneizar la muestra de tejido estéril y diluirla seriadamente 10 veces. En cada dilución, normalmente se inoculan en el cerebro 6 ratones (10 ~ 30 μl), ratas (30 μl) o hámsteres (50 μl). Los animales vacunados fueron inspeccionados cada 3 días y se encontraron síntomas como desorden del pelo, joroba, movimientos lentos y parálisis de las extremidades traseras. Después de eso, fueron examinados y sacrificados todos los días, y se les extrajo tejido cerebral para un examen patológico para verificar la infección por priones. Si los animales vacunados no enferman, se les seguirá observando hasta su muerte o transmisión ciega a tiempo, y finalmente se tomará el tejido cerebral para examen patológico. Calcular el título en función del número de morbilidades y muertes de animales. La ventaja de este método es que es sensible y es un experimento importante para estudiar las propiedades biológicas de los priones. Sus desventajas son el consumo de tiempo, la mano de obra, un gran error de titulación, el consumo de una gran cantidad de animales y el alto precio. Las tasas de éxito de la transmisión a menudo varían ampliamente debido a las barreras entre especies, cepas y animales individuales, y la transmisión animal de cepas individuales de GSS nunca ha sido exitosa. Por lo tanto, una prueba negativa no puede descartar la infección por priones. El uso de animales genéticamente modificados es un método experimental económico y práctico para debilitar o eliminar las barreras entre especies, lo que puede mejorar significativamente el efecto de transmisión.
2 Métodos inmunológicos
Los métodos de detección inmunológica se han convertido en el método más importante para detectar priones debido a su alta sensibilidad, fuerte especificidad y múltiples métodos que pueden satisfacer las necesidades de diferentes pruebas. requisitos.
(1) Impresión de tejidos: la tecnología de impresión de tejidos es una combinación de tecnología de detección de proteínas sensibles y tecnología de preservación de tejidos anatómicos, y se utiliza para detectar trazas de PrPsc en los tejidos. Su sensibilidad es muy alta, superando incluso la de la inmunotransferencia general, y se ha utilizado ampliamente en la investigación de priones.
(2) Dot blot: En 1990, Serban et al. introdujeron el método dot blot tratado con tiocianato de guanidinio. Las muestras de tejido se homogeneizaron en tampón de lisis frío y luego se centrifugaron a 500 rpm durante 5 minutos para eliminar los residuos insolubles. Mezcle el sobrenadante y el tampón de muestra SDS en cantidades iguales, tome 4 μl de la mezcla, colóquelo sobre la membrana NC seca, séquelo y digiéralo con iK, 3. El método de hibridación por puntos tiene baja sensibilidad, pero es simple de operar y requiere poco equipo. Es adecuado para examinar grandes lotes de muestras y es fácil de promover.
(3) Western blot: debido al uso de tecnología de separación por electroforesis en gel y tecnología de inmunoensayo, no solo puede identificar componentes específicos en la muestra, sino que también muestra su patrón de separación por electroforesis, que tiene un alto valor de aplicación. . La tecnología de transferencia Western es simple y rápida, requiere pocos instrumentos y equipos y no se ve afectada por la autólisis del tejido. Puede detectar PrPres cuando los resultados histopatológicos son negativos o ambiguos y tiene el valor de un diagnóstico temprano. Se ha convertido en uno de los métodos de detección más utilizados en la investigación de priones. Los pasos básicos son los siguientes: Después de una serie de tratamientos, como homogeneización, centrifugación, digestión con proteinasa K, etc. Las muestras de tejido que se van a analizar se someten a electroforesis en un gel de poliacrilamida SDS 12,5 y luego las proteínas se transfieren a una membrana NC o una membrana de PVDF, se sellan y se detectan inmunológicamente utilizando anticuerpos específicos.
(4) Inmunohistoquímica: la inmunohistoquímica utiliza anticuerpos específicos para mostrar directamente la PrP patógena en secciones de tejido. Debido a que puede localizar anatómicamente el depósito de PrPres, proporciona una base objetiva para el diagnóstico clínico patológico y tiene un alto valor de diagnóstico clínico. La inmunohistoquímica puede detectar muestras de tejido fijadas con formaldehído e incluidas en parafina y tiene una amplia gama de aplicaciones. Los pasos básicos son los siguientes: después de una serie de tratamientos previos, las muestras de tejido fijadas con formaldehído o incluidas en parafina se hacen reaccionar con anticuerpos específicos y anticuerpos secundarios marcados con enzimas en secuencia, y finalmente se agrega un sustrato para el desarrollo del color y se observa bajo un microscopio. .
(5) Enzimoinmunoensayo (ELISA): Este método es sensible, específico, sencillo, rápido, cuantitativo y automatizado, y es muy adecuado para cribar grandes cantidades de muestras. Actualmente existen dos métodos ELISA para detectar priones: uno es el método indirecto, en el que el PrPres extraído de cada muestra se recubre en los pocillos de una placa de enzimas y el otro es el método sándwich de doble anticuerpo, que primero utiliza una capa específica de la enzima; placa con el anticuerpo, agregar la solución de extracción de muestra e incubar a 37°C. Luego, se añaden secuencialmente el anticuerpo de especificidad 1 y el anticuerpo ELISA 2 en los dos métodos y, finalmente, se añade el sustrato para desarrollar el color y se lee la placa ELISA.
(6) Varias precauciones para el pretratamiento de muestras en pruebas inmunológicas: ① El pretratamiento de muestras apropiado puede exponer epítopos de PrPres previamente ocultos y/o reparar epítopos destruidos por formalina, mejorar la inmunorreactividad de PrPres es propicio para mejorar el experimento. sensibilidad. ②El preprocesamiento no es una panacea y muchos preprocesamientos han fallado. El efecto del pretratamiento puede depender de si los epítopos expuestos o reparados mediante el pretratamiento son reconocidos por los anticuerpos utilizados en el experimento. ③ Ciertos métodos de pretratamiento (como el tratamiento con vapor a alta presión) pueden aumentar simultáneamente la inmunorreactividad de PrPsen, pero esto no favorece la detección de PrPsen. Yokoyama cree que esto se debe simplemente a una baja expresión de PrPsen. ④Los anticuerpos utilizados en algunos experimentos no pueden distinguir entre PrPres y PrPsen, y la digestión con PK no se utiliza para eliminar PrPsen. El objetivo principal de estos experimentos es utilizar las diferencias entre PrPres y PrPsen para detectar las condiciones previas al tratamiento para maximizar la inmunorreactividad de los anticuerpos utilizados con PrPres, suprimir la inmunorreactividad con PrPsen y ampliar la diferencia en los resultados experimentales entre los dos, logrando así. con el fin de detectar organismos que infectan las EET. ⑤ Sin pretratamiento de la muestra, la sensibilidad de detección también se puede mejorar simplemente seleccionando anticuerpos mejorados.
3 Métodos de detección con instrumentos especiales
(1) Microscopía electrónica: el uso de microscopía electrónica para detectar fibras asociadas a la picazón (SAF) es otro método para la detección de priones. PrPsc ahora se considera parte integral de SAF. Las fibras asociadas con la picazón son estructuras fibrosas en forma de bastón, que en realidad son productos de PrPsc extraídos con detergentes en diferentes condiciones de extracción. No se encontró SAF en secciones de tejido de organismos infectados. Los pasos básicos son los siguientes: Homogeneizar el tejido de prueba en solución de 10 N-laruoil sarcosina, realizar centrifugación diferencial, digestión PK, resuspender en agua destilada, tinción negativa y observar bajo un microscopio electrónico. Bajo el microscopio se pueden ver dos fibras macromoleculares exclusivas de la picazón. La sensibilidad de la microscopía electrónica para SAF es menor que la de la transferencia Western.
(2) Electroforesis capilar en gel SDS: este método purifica principalmente PrPsc mediante métodos físicos y químicos: centrifugación diferencial, ultracentrifugación, tratamiento con N-lauroil sarcosina sódica y PK, y luego se realizó electroforesis capilar en gel SDS. en un Beckman P/ACE 5 500. Según el tiempo y la forma del pico de absorción en la longitud de onda de 265438 ± 04 nm cuando cada componente pasa a través del detector, se puede identificar el patógeno PrPsc de la tembladera. Este método tiene las ventajas de un pequeño consumo de muestra, sin necesidad de reactivos inmunológicos y un juicio intuitivo. La desventaja es que requiere una ultracentrífuga y un equipo especial de electroforesis capilar.
(3) Inmunoensayo de electroforesis capilar de cadenas peptídicas marcadas fluorescentemente: este método se basa en el principio de competencia inmune y utiliza electroforesis capilar sin zonas combinada con tecnología de inmunofluorescencia para detectar trazas de PrPse en la muestra. El principio básico es marcar con fluorescencia la cadena peptídica específica de PrPsc sintetizada artificialmente (142 ~ 154) y luego utilizar una cierta cantidad de anticuerpos específicos y extracto de cerebro de oveja para la electroforesis. Después de que la cadena peptídica marcada con fluorescencia se une al anticuerpo, su movilidad cambia y, por lo tanto, se separa de la cadena peptídica marcada libre. Debido a que la cantidad de anticuerpo solo puede unirse a aproximadamente el 50% de la cadena peptídica marcada, la cadena peptídica unida marcada fluorescentemente es similar a la cadena peptídica marcada libre. Cuando hay una pequeña cantidad de PrPsc en el extracto de cerebro de oveja, debido a que compite con la cadena peptídica marcada por la unión al anticuerpo, la proporción entre la cadena peptídica unida y la cadena peptídica libre cambia, lo cual es detectado por el instrumento. Este método es muy sensible y puede detectar 135 pg de PrPsc, y puede usarse para detectar niveles bajos de priones en tejidos extracerebral (como la sangre).
(4) Método de escaneo de objetivo de fluorescencia intensa de dos colores: este método utiliza * * * tecnología espectroscópica de correlación de fluorescencia enfocada de dos colores para detectar cantidades extremadamente pequeñas de priones. El principio básico es aprovechar las características de los PrPres patógenos, que pueden autorreplicarse y agregarse espontáneamente en condiciones adecuadas, y marcar la PrP recombinante (rPrP) con fluorescencia verde. Después de combinar la conformación normal de PrPres y rPrP, se copia una gran cantidad de tapas de rPrP con conformación anormal mediante transformación alostérica. Dado que PrPres se agrega espontáneamente bajo ciertas condiciones, una gran cantidad de tapas de rPrP se acumulan alrededor de PrPres, lo que hace que su intensidad de fluorescencia sea 50 veces mayor que la del RPRP libre. Al mismo tiempo, para mejorar la especificidad del experimento, se añadió un anticuerpo monoclonal específico marcado con fluorescencia roja, de modo que los agregados cubiertos de PrPres-rPrP se marcaron con fluorescencia roja. El instrumento de detección solo puede considerar como PrPres las partículas que emiten fluorescencia roja y verde de alta intensidad al mismo tiempo.
Actualmente, muchos aspectos del campo de los priones aún están en blanco o son poco comprendidos por los humanos, como el grado en que los priones se transmiten a través de barreras entre especies, el riesgo de transmisión a través de productos biológicos y medicina clínica, y la exploración de otras vías de transmisión, investigación sobre la patogénesis de los priones, etc. Muchos problemas son inseparables de la detección de priones, y el desarrollo de métodos de detección de priones ciertamente abrirá amplias perspectivas para la investigación de priones.