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La tolerancia específica al trasplante significa que el sistema inmunológico del receptor no produce una respuesta inmune a los antígenos alogénicos o xenogénicos del donante durante un tiempo prolongado, pero puede producir respuestas inmunes normales a otros antígenos sin el uso de fármacos inmunosupresores. . Actualmente se cree que la inducción de la tolerancia inmunitaria implica cuatro mecanismos: aclaramiento inmunitario, incompetencia inmunitaria, supresión inmunitaria y negligencia inmunitaria. Desde que Petersen et al. descubrieron en 1999 que las células ovaladas del hígado pueden derivarse de la médula ósea, la identificación de células madre hepáticas a partir de células de la médula ósea se ha convertido en un tema candente en los últimos años. Los estudios han confirmado que múltiples subpoblaciones de células madre hematopoyéticas aisladas y purificadas de la médula ósea pueden diferenciarse en células madre hepáticas bajo ciertos microambientes o inducción de citoquinas [B]. Se ha descubierto que muchas subpoblaciones de células de la médula ósea tienen el potencial de diferenciarse en hepatocitos. Como células KTLS (c-kithighylowlin-SCA-1+) [h], células β2-m-Thy-1+ [12], células precursoras adultas multipotentes CD44-CD45-HLA-c-kit (multipotables). En estas células intervienen muchos marcadores de superficie diferentes, que pueden representar diferentes etapas de desarrollo o diferentes ramas de células madre de la médula ósea. Estas citoquinas deben existir en el microambiente de las células, incluidas las moléculas de señalización involucradas en el proceso de adhesión en la matriz extracelular y las citocinas involucradas en el desarrollo, diferenciación y maduración celular normal [B] [E]. Los estudios de Petersen et al [L], Theise et al [M, N] y Alison et al [O] han señalado sucesivamente que las células madre de la médula ósea o células madre hematopoyéticas pueden transformarse en células ovaladas del hígado o incluso en hepatocitos maduros y bilis. células del conducto en el hígado del ratón demostraron que este fenómeno también existe en el cuerpo humano. Se indujeron células de médula ósea de rata cultivadas in vitro mediante altas concentraciones de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y se detectó la expresión de albúmina y alfafetoproteína mediante RT-PCR. La inmunocitoquímica también confirmó que las células inducidas tenían la expresión característica de células precursoras del hígado como AFP, albúmina y CK8/18. Las células β2m-Thy-1+ se aíslan de células de médula ósea humana o de rata mediante cribado de células de cepa magnética y pueden expresar las características de los hepatocitos [P]. Estas células madre hepáticas derivadas de la médula ósea (BDHSC) se integran rápidamente en la placa hepática después del trasplante intrahepático y se diferencian en hepatocitos maduros. La adición de suero biliar durante el cultivo in vitro puede promover su diferenciación en hepatocitos. Cai Yunfeng et al. aislaron con éxito múltiples subpoblaciones de células madre de médula ósea utilizando el método de perlas inmunomagnéticas y demostraron que las células β2 microglobulina negativas (β2 m-) en la médula ósea de rata se transformaron en células poligonales después de la inducción mediante cultivo in vitro de albúmina. AFP, CK8/1 8 fue positiva, mientras que otros tipos de células madre no mostraron cambios similares. Se sugiere que este subconjunto de células madre de la médula ósea tiene la capacidad de diferenciarse en células madre del hígado. Según el método que introdujeron, aislamos con éxito células madre hepáticas del orden de 1,5 × 105. La pureza es del 95% y puede alcanzar el nivel de 2×106 después de 7 días de cultivo. La tinción inmunohistoquímica mostró que tiene marcadores específicos para hepatocitos, células epiteliales de los conductos biliares y células endoteliales vasculares, por lo que se especula que puede diferenciarse en los tres tipos de células anteriores (consulte las bases del trabajo de investigación). Estos resultados indican que hay células madre en las células de la médula ósea que pueden diferenciarse en células del hígado.
Un gran problema con la terapia génica hepática es que los hepatocitos maduros modificados genéticamente no pueden expandirse ni pasarse fácilmente in vitro. Las células madre hepáticas tienen una gran capacidad para proliferar y aún pueden transmitirse incluso después de una modificación genética, lo que abre una nueva vía para superar los principales problemas de la terapia génica actual. Como portador, las células madre hepáticas tienen las características de una intervención única y un tratamiento permanente. Las células madre hepáticas inmortalizadas no causan cáncer [F].
Con base en los resultados de la investigación anterior, planteamos la hipótesis de que las células madre hepáticas pueden atacar y colonizar alrededor de la vena central en el área porta del hígado y, si es necesario, pueden diferenciar y reponer las células endoteliales vasculares dañadas o envejecidas, la bilis. células epiteliales de los conductos y hepatocitos.
Utilizando virus adenoasociado como vector, el gen DcR3 se transfirió a células madre hepáticas aisladas y purificadas de la médula ósea de ratas Wistar endogámicas macho, y los hígados de ratas Wistar endogámicas hembra se trasplantaron a ratas Lewis endogámicas hembra. transfectados con el gen DcR3 se inyectaron en el hígado trasplantado a través de la vena porta. Con la colonización de las células madre hepáticas, el gen DcR3 se sigue expresando principalmente en la zona portal. Si es necesario, con la diferenciación adicional de las células madre hepáticas se expresa parcialmente en células endoteliales vasculares, células epiteliales de los conductos biliares y hepatocitos. en el inicial (primario) y en los dos eslabones de ataque (secundario) inhiben la aparición de la reacción de rechazo. El fuerte efecto inmunosupresor del gen DcR3 se localiza en el hígado, induciendo así un estado de tolerancia al trasplante específico del hígado.
Referencia
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2. Contenido de la investigación, objetivos de la investigación y cuestiones clave a resolver. (El enfoque de esta parte es el contenido)
2.1 Contenido de la investigación
2.1.1 Construir un vector de virus adenoasociado que lleve el gen DcR3, transfectarlo en células AAV293 y recolectar Partículas del virus AAV para su uso posterior.
2.1.2 Extraer médula ósea del fémur y tibia de ratas Wistar endogámicas macho, aislar células madre hepáticas, transfectar las partículas de virus adenoasociadas anteriores e identificar su expresión.
2.1.3 Implantar el hígado de una rata Wistar endogámica hembra en el cuerpo de una rata Lewis endogámica hembra e inyectar las células madre hepáticas transfectadas de una rata Wistar endogámica macho en el hígado a través de la vena porta.
2.1.4 Determinar la colonización y distribución de células madre hepáticas transgénicas en el hígado del donante en función del cromosoma Y y el marcador de proteína verde fluorescente (GFP) del vector viral AAV.
2.1.5 Detectar la expresión del gen DcR3 transferido a células madre hepáticas en el hígado del donante.
2.1.6 Observar la aparición de rechazo de trasplante después del trasplante de hígado.
2.2 Objetivos de la investigación: Este proyecto pretende construir un virus adenoasociado que lleve el gen DcR3 y transfectarlo en células madre hepáticas derivadas de la médula ósea de ratas Wistar endogámicas macho. Se implantó en Lewis endogámicos hembra; ratas, y las células madre hepáticas transfectadas con el gen DcR3 se inyectaron en el hígado trasplantado a través de la vena porta. El gen DcR3 se expresa durante mucho tiempo en el hígado del donante, induciendo así un estado de tolerancia al trasplante específico del hígado. Explorar (1) la colonización y distribución de células madre hepáticas transgénicas en hígados de donantes. (2) Expresión del gen DcR3 introducido en células madre hepáticas del hígado del donante. (3) La distribución de células madre hepáticas transgénicas en hígados de donantes y su relación con la expresión genética y la tolerancia al trasplante.
2.3 Cuestiones clave que deben resolverse
2.3.1 Eficiencia de la transfección de células madre hepáticas con virus adenoasociados: la transfección genética de células madre es difícil y es una de las claves aspectos de este proyecto. Un miembro de este proyecto (eliminado) infectó con éxito células madre neurales con adenovirus en 2001, con una tasa de éxito de alrededor del 80% al 90%. Todavía tienen características de células madre después de 12 generaciones de subcultivo. La eficacia de transfección del virus adenoasociado es mayor que la del adenovirus y puede transfectar una gama más amplia de tipos de células que el adenovirus. Por tanto, nuestro grupo de investigación tiene la capacidad de completar la transfección de células madre hepáticas con virus adenoasociados.
2.3.2 El número de células madre hepáticas transgénicas que colonizan el área porta del hígado donante: El número de células madre hepáticas transgénicas que colonizan el área portal está relacionado con el grado de daño hepático.
Cuanto más grave es la lesión, mayor es el número de células madre hepáticas que colonizan el área portal y viceversa. La isquemia-reperfusión hepática es un tipo de daño al hígado durante el trasplante de hígado. Para aumentar aún más la cantidad de células madre hepáticas en el área portal, se puede extraer una hoja del hígado de rata durante el almacenamiento en frío y luego se puede completar el trasplante de hígado.
3. Proponer un plan de investigación y análisis de viabilidad. (Incluyendo descripciones de métodos relevantes, rutas técnicas, medios experimentales y tecnologías clave)
3.1 Protocolo de investigación
3.1.1 El gen DcR3 se clonó de acuerdo con el método introducido por Pitti RM et Alabama.
3.1.2 Construir un vector de virus adenoasociado que lleve el gen DcR3, utilizarlo para infectar células AAV-293 para la identificación de la expresión in vitro y recolectar partículas de virus AAV para su uso posterior.
3.1.3 Tomar médula ósea del fémur y tibia de ratas Wistar macho, aislar, purificar e identificar células madre hepáticas según el método introducido por Itzhak Avital.
Las células madre hepáticas se transfectaron con el vector de virus adenoasociado 3.1.4 y se infectaron directamente.
3.1.5 Prueba in vitro: Las células madre hepáticas que expresan el gen DcR3 inhiben la apoptosis de los linfocitos inducida por FasL; las células madre hepáticas que expresan el gen DcR3 inhiben la quimiotaxis de los linfocitos inducida por FasL
3.1. 6 Experimentos con animales: el trasplante de hígado de rata se realizó mediante el método de la manga. Después del trasplante, se inyectaron en el hígado células madre hepáticas transfectadas con el gen DcR3 a través de la vena porta en los días 3, 7, 65, 438+04, 26, del postoperatorio. y 438+0, respectivamente. Se recogieron muestras de sangre y de hígado el día 28 y el día 28. La función hepática se detectó mediante métodos bioquímicos convencionales. La expresión del gen DcR3 en el hígado se detectó mediante transferencia Northern y transferencia Western. y los linfocitos CD8+ en el hígado del donante se detectaron mediante inmunohistoquímica. Se utilizó el método TUNEL para detectar la apoptosis de las células del medio del hígado del donante.
3.2 Ruta técnica
3.3 Análisis de viabilidad
3.3.1 Teóricamente, las células madre hepáticas derivadas de la médula ósea son células ovaladas y precursoras de basófilos en el área portal del hígado. células de pequeños hepatocitos. Los estudios han demostrado que los túbulos de Hering en el área portal de los hígados trasplantados con células madre hepáticas inyectadas a través de la vena porta pueden diferenciarse en células endoteliales vasculares, células epiteliales de los conductos biliares y hepatocitos. El área portal es la primera área de infiltración de las células CTL en el rechazo del trasplante de hígado. Las células endoteliales vasculares, las células epiteliales de los conductos biliares y los hepatocitos son las células diana atacadas por las células CTL. Por lo tanto, es teóricamente factible que las células madre hepáticas lleven genes inmunosupresores transfectados al hígado y continúen expresándolos en células endoteliales vasculares, células epiteliales de los conductos biliares y hepatocitos, induciendo así tolerancia al trasplante específica del hígado.
3.3.2 Las tecnologías involucradas en esta investigación son todas tecnologías inmunológicas maduras; nuestro instituto cuenta con el equipo y las condiciones necesarias para realizar esta investigación.
4. Características e innovaciones de este proyecto.
Este estudio utiliza la colonización y diferenciación dirigida de células madre hepáticas en el hígado como portador de moléculas inmunosupresoras, de modo que los efectos de las moléculas inmunosupresoras no específicas se limitan al hígado, superando el problema del exceso. alcance de las moléculas inmunosupresoras, induciendo así un estado de tolerancia al trasplante específico del hígado.
5. Plan anual de investigación y resultados esperados de la investigación. (Incluyendo importantes actividades de intercambio académico, planes de cooperación e intercambio internacional a organizar, etc.)
Plan Anual de Investigación
Del 2005.01 al 2005.09 se clonó el gen DcR3 y el adeno- Se construyó el gen asociado que porta el gen DCR3.
Desde octubre de 2005 hasta junio de 2006, se aislaron, purificaron e identificaron células madre hepáticas procedentes de la médula ósea de ratas endogámicas macho, y se transfectaron con virus adenoasociados. Expresión in vitro e identificación del gen DcR3: experimento funcional in vitro del gen DcR3 transfectado.
El modelo animal de trasplante de hígado se completó entre julio de 2006 y junio de 2007, y las células madre hepáticas transfectadas se inyectaron en el hígado a través de la vena porta. Se tomaron muestras de hígado con regularidad para determinar la colonización y distribución de células madre hepáticas transgénicas en el hígado del donante basándose en la tinción del marcador del cromosoma Y y la GFP. Detectar la expresión de genes transferidos a células madre hepáticas en el hígado;
Julio de 2007-junio de 2007, 438+2 meses 2007, complementando experimentos faltantes, organizando datos experimentales, procesando estadísticamente datos experimentales y escribiendo artículos.
Resultados esperados de la investigación
1. Demostrar que las células madre hepáticas transfectadas con el gen DcR3 pueden continuar expresándose en el área del portal donante y en algunas células endoteliales vasculares, células epiteliales de los conductos biliares y células hepáticas. e Inducir tolerancia inmune a largo plazo en el trasplante de hígado.
2. Publicar de 2 a 3 artículos en revistas académicas extranjeras, de 6 a 8 artículos en revistas nacionales principales y comunicarse en conferencias académicas nacionales.
(2) Base de la investigación y condiciones laborales
1. Base del trabajo (acumulación de trabajo de investigación y resultados del trabajo de investigación relacionados con este proyecto)
La puntuación es 2. Sale entre finales de mes y principios de marzo.
2. Condiciones de trabajo (incluidas las condiciones experimentales existentes, deficiencias en las condiciones y soluciones experimentales, incluidos los planes y la implementación de laboratorios clave nacionales y laboratorios abiertos departamentales).
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3. Currículum vitae del solicitante (incluidas las calificaciones académicas y los currículums de trabajos de investigación del solicitante y miembros clave del equipo del proyecto, una lista de los principales trabajos publicados recientemente relacionados con este proyecto, premios académicos recibidos y experiencia laboral en este proyecto).
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(3) Descripción de la solicitud del fondo (debe completarse cuidadosamente de acuerdo con las "Medidas de gestión de fondos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China", el fondo es de más de 50.000 yuanes) Para la adquisición de activos fijos y equipos, la relevancia directa y la necesidad de la investigación del proyecto deben explicarse punto por punto)
(4) Lista de otros archivos adjuntos (copie los archivos adjuntos y envíelos junto con el formulario de solicitud en papel) (Una lista de archivos adjuntos que se deben enviar junto con el formulario de solicitud en papel, como cartas de recomendación de solicitantes con títulos técnicos intermedios o cartas de recomendación de supervisores de proyectos de solicitud de posgrado en servicio).