Buscando materiales relacionados sobre cultivo de tejidos de Euonymus rotunda.
(1) Principio
El cultivo celular simula las condiciones fisiológicas en el cuerpo de la computadora. Las células se extraen del cuerpo y se les permite sobrevivir, crecer, reproducirse y pasar bajo condiciones artificiales para estudiar los procesos de la vida celular, el cáncer celular, la ingeniería celular y otras cuestiones. En los últimos años, se ha utilizado ampliamente en biología molecular, genética, inmunología, oncología, ingeniería celular y otros campos, y se ha convertido en una biotecnología importante con logros notables. La toma de tejidos o células directamente del cuerpo para su cultivo se denomina cultivo primario. Las células cultivadas primarias tienen un tiempo corto de vida in vitro y propiedades similares a las in vivo, lo que las hace adecuadas para la investigación. En general, es más probable que los tejidos y células inmaduros, como los embriones de animales y los órganos de niños pequeños, se cultiven en cultivos primarios.
(2) Instrumentos, materiales y reactivos
Instrumentos: incubadora (ajustada a 28°C), frascos de cultivo, frascos de penicilina, pequeños embudos de vidrio, platos planos, pipetas, gasas, instrumentos quirúrgicos, tablero de recuento de células sanguíneas, centrífuga, baño de agua (20 ℃).
Materiales: almejas spinnaker de menos de tres años.
Reactivos: solución de permanganato de potasio 0,01, etanol 75, medio MEM o medio 1640 (que contiene 10-20 suero de ternera), tripsina 0,25, solución de Hank o solución PBS, yodo.
(3) Operación
1. Materiales de dibujo
Hacer que los animales mueran rápidamente. Remoje todo el animal en una solución de permanganato de potasio al 0,01 durante 30 minutos, luego colóquelo en un vaso que contenga etanol al 75% y déjelo en remojo durante unos segundos para desinfectarlo. Después de sacarlo, colóquelo en un plato plano grande y llévelo al. mesa ultralimpia. Utilice tijeras esterilizadas para cortar nuevamente la piel desinfectada con yodo y etanol y extraiga el hígado o los riñones mediante laparotomía. Colocar en un plato esterilizado.
Corte
Enjuague el órgano tres veces con solución de PBS estéril, luego corte cuidadosa y repetidamente el tejido con tijeras oftálmicas hasta convertirlo en un pequeño trozo de aproximadamente 1 mm3, luego enjuague con PBS hasta el tejido se vuelve blanco. Transfiera a un tubo de centrífuga estéril y déjelo reposar durante unos minutos para permitir que los trozos de tejido se asienten naturalmente en el fondo del tubo. Deseche el sobrenadante.
3. Digestión, inoculación y cultivo
Aspirar 1 ml de solución de digestión mezclada con 0,25 de tripsina y 0,02 de EDTA, añadirlo al tubo de centrífuga, mezclar con el bloque de tejido, añadir un tapón de la boquilla y digerir en un baño de agua a 20 °C durante 8 a 10 minutos, agitar el tubo de ensayo cada pocos minutos para que el tejido entre en contacto completamente con el jugo digestivo, dejar reposar, aspirar el sobrenadante y agregar 5 a 650.
(4) Resultados
Las células generalmente se adhieren a la pared y comienzan a crecer unas horas después de la siembra. Si las células se siembran con la densidad adecuada, se puede formar una monocapa en 5 días a una semana.
Antes de digerir las células del hígado, utilice un bisturí (corte) para cortar el tejido del hígado en trozos cuadrados de aproximadamente 1 mm (3) y utilice hialuronidasa/colagenasa (0,032 g de enzima/30 ml de medio de cultivo). 1 hora a 24 grados centígrados, agitando cada 10-15 minutos en promedio.
Cultivo primario de células
1. Principios
Elimine varios tejidos de cuerpos animales del cuerpo y utilice varias enzimas (tripsina de uso común), mezclas de quelatos. (comúnmente EDTA) o tratamiento por método mecánico, dispersados en células individuales, cultivadas en un medio adecuado, para que las células puedan sobrevivir, crecer y reproducirse. Este proceso se llama cultivo primario.
II. Instrumentos, materiales y reactivos
Instrumentos: incubadora (ajustada a 37°C), frascos de cultivo, frascos de penicilina, pequeños embudos de vidrio, placas de petri, pipetas, gasas quirúrgicas. instrumentos, tablero de recuento de células sanguíneas, centrífuga, baño de agua (37 ℃).
Materiales: Ratas fetales o ratas recién nacidas.
Reactivos: Medio 1640 (que contiene un 20% de suero de ternera), tripsina al 0,25%, solución de Hank, yodo.
3. Pasos de la operación
(1) Método de digestión con tripsina
1. Equipo: tirar de las vértebras cervicales de ratones preñados o recién nacidos hasta matarlos y remojarlos. en alcohol al 75% durante 2-3 segundos (el tiempo no debe ser demasiado largo para evitar que el alcohol se infiltre en el cuerpo desde la boca y el ano), luego desinfecte el abdomen con yodo, coloque el feto de rata en una mesa limpia (o rata recién nacida sobre una mesa limpia), diseccione el hígado y colóquelo en un plato plano en el medio.
2. Lavar tres veces con solución de Hank para eliminar grasa, tejido conectivo, sangre y otras impurezas.
3. Utilice tijeras quirúrgicas para cortar el hígado en trozos pequeños (1 mm2), luego enjuague tres veces con la solución de Hank y transfiéralo a un frasco pequeño de penicilina.
4. Añadir solución de tripsina 0,25 5-6 veces la cantidad de tejido, digerir a 37°C durante 20-40 minutos, agitar cada 5 minutos o soplar con una pipeta para separar las células.
5. Añadir 3-5ml de medio de cultivo para detener la digestión de tripsina (o añadir inhibidor de tripsina).
6. Déjelo reposar durante 5-10 minutos para permitir que los bloques de tejido no divididos se hunda y agregue la suspensión al tubo de centrífuga.
7. Centrifugar a 1000 rpm durante 10 minutos y desechar el sobrenadante.
8. Añadir 5ml de solución de Hank para dispersar las células, centrifugar nuevamente y descartar el sobrenadante.
9. Añadir 1-2 ml de medio (dependiendo del número de células) y contar con un hemocitómetro.
10. Ajustar las células a aproximadamente 5×105/ml, transferir a un matraz de cultivo celular de 25 ml y cultivar a 37°C.
El método de digestión y separación anterior es el método más básico. Basado en este método, se pueden separar aún más diferentes células. Diferentes laboratorios tienen diferentes métodos de separación celular y utilizan diferentes enzimas digestivas (como colagenasa, hialuronidasa, etc.).
(2) Método de cultivo directo de bloques de tejido
Después del tercer paso Una vez completado el método anterior, transfiera el bloque de tejido al frasco de cultivo y péguelo en el fondo del frasco. Gire el fondo de la botella hacia arriba y agregue medio de cultivo a la botella. El líquido de cultivo no debe entrar en contacto con el bloque de tejido. Deje reposar a 37°C durante 3-5 horas, gire suavemente el frasco de cultivo para sumergir el tejido en el medio de cultivo (no deje que el tejido flote) y continúe cultivando a 37°C.
IV.Precauciones
1. Desde el inicio del muestreo, mantener todos los tejidos y células en condiciones estériles. El recuento celular se puede realizar en presencia de bacterias.
2. En un laboratorio ultralimpio, tejidos, células, medios de cultivo, etc. No debe exponerse por mucho tiempo para evitar la evaporación de la solución.
3. En todos los pasos fuera de la mesa de limpieza, cada recipiente debe estar cubierto con una tapa o tapón de goma para evitar la caída de bacterias.
5. Varias precauciones para operaciones asépticas
1. Lávese las manos antes de la cirugía y trate de limpiarlas con alcohol al 75% o clormetionina al 0,2% después de ingresar a la mesa ultralimpia. . También se deben limpiar las bocas de los frascos, como los de los reactivos.
2. Encienda la lámpara de alcohol y utilícela cerca de la llama. Los artículos resistentes al calor siempre deben quemarse sobre una llama. Los instrumentos metálicos no deben quemarse durante demasiado tiempo para evitar el recocido, y el tejido sólo puede extraerse después de enfriarse. Los recipientes que hayan absorbido la solución nutritiva no se pueden volver a quemar para evitar quemarse y formar una película de carbón.
3. La operación debe ser precisa y rápida, pero no demasiado rápida para evitar el flujo de aire y aumentar las posibilidades de contaminación.
4. No toque las partes de trabajo del equipo de desinfección con las manos, y los elementos en el banco de trabajo deben colocarse de manera razonable.
5. Intenta mantener la botella inclinada a 45 grados después de abrirla.
6. Las pipetas utilizadas para la solución no deben mezclarse.
Adjunto: Fórmula líquida de Hank:
0,06g KH2PO4, 0,06g NaCl, 0,35g nahco3, 0,4g KCl, 1,0g glucosa, Na2HPO4? H2O
0,06 g, añadir H2O hasta 1000 ml.
Nota: La solución de Hank se puede esterilizar en autoclave. Conservar a 4°C.
Cultivo y establecimiento de células primarias
Las células provienen de diversas fuentes y los métodos de cultivo también son diferentes. Todas las células cultivadas primarias derivadas de embriones, tejidos y órganos, y de sangre periférica y preparadas mediante métodos de aislamiento especiales se denominan células primarias. El método de inoculación dispersa de células primarias se llama pases.
Las células que se pueden cultivar nuevamente mediante subcultivo se denominan células de paso. Si una línea celular puede crecer de manera estable y transmitirse durante más de 10 a 20 generaciones, se puede establecer. La purificación de clones de células individuales se puede llevar a cabo si las condiciones lo permiten, y la población de células clonales con propiedades biológicas estables formada después de una expansión a gran escala se denomina cepa celular o célula clonal. Este proceso se llama purificación celular o clonación celular. Estas técnicas básicas son la base del cultivo celular. Sólo cuando esté familiarizado y domine las técnicas básicas podrá aprender y dominar otros métodos más rápidamente. Este capítulo se centra en las técnicas básicas de uso común.
La primera parte de los materiales de baterías primarias
Los materiales obtenidos de células humanas y animales son la primera condición para un cultivo celular primario exitoso y el primer paso en el cultivo celular. La recolección inadecuada de material afectará directamente el cultivo celular in vitro. Los requisitos y precauciones básicos para la recolección de materiales son los siguientes:
1. Requisitos básicos para los materiales
(1) Preste atención al recolectar materiales frescos y los tejidos frescos son fáciles de cultivar con éxito. . Al recolectar materiales, intente producir células en un plazo de 4 a 6 horas y colóquelas en una caja para cultivo lo antes posible. Si el cultivo no se puede realizar inmediatamente, debemos remojar el tejido en medio de cultivo y almacenarlo a 4°C. Si el bloque de tejido es grande, se debe cortar en pedazos y, después de eliminar los coágulos de sangre superficiales, el tejido necrótico, la grasa y el tejido conectivo, se debe almacenar en medio de cultivo a 4°C, pero el tiempo no debe exceder las 24 horas. Para tejidos picados, sangre y tejidos linfoides, se debe agregar un medio que contenga 10% de dimetilsulfóxido y congelarse en nitrógeno líquido según el método de criopreservación celular.
(2) Los materiales de muestra deben ser estrictamente estériles. Para garantizar la esterilidad, si se sospecha que el material está contaminado, el tejido debe almacenarse a 4°C durante más de 2 horas en un medio que contenga altas concentraciones de antibióticos (400 unidades/ml) o incluso añadiendo una cantidad adecuada de anfotericina B. o solución de 10 diclonina, y luego lavar con PBS 2 a 3 veces para asegurar la esterilidad del material. Los materiales deben tomarse de recipientes o viales estériles que contengan una pequeña cantidad de solución de cultivo (que contenga 400 unidades/ml de antibiótico) y otros artículos portátiles. Los materiales utilizados deben evitar el contacto con productos químicos tóxicos y nocivos como el yodo y el mercurio.
(3) Al tomar materiales y fabricar células primarias, utilice herramientas afiladas, como bisturís o hojas de afeitar, para triturar el tejido y minimizar el daño mecánico a las células.
(4) Retire con cuidado la sangre (coágulos de sangre), la grasa, el tejido necrótico y el tejido conectivo de los materiales tomados. Evite secar el tejido al cortarlo en pedazos. Puede colocarlo en un recipiente con una pequeña cantidad. de la conducta de la cultura.
(5) Se debe prestar atención al tipo de tejido, grado de diferenciación, edad, etc. En términos generales, los tejidos embrionarios son más fáciles de cultivar que los tejidos individuales maduros, los tejidos poco diferenciados y altamente diferenciados son más fáciles de cultivar y los tejidos tumorales son más fáciles de cultivar que los tejidos normales. Al recolectar materiales, intente seleccionar tejidos que sean fáciles de cultivar para el cultivo.
(6) Al recolectar células primarias, se deben conservar tanto las muestras histológicas como las de microscopía electrónica. El origen y ubicación de la organización, incluyendo información general sobre el donante, se registran detalladamente para futuras consultas.