¿La actina de referencia interna para la transferencia Western es de 43 o 45 kda?

Western blot puede demostrar que una muestra contiene una determinada proteína. Su función más importante es comparar la expresión relativa de la proteína diana en diferentes condiciones o en diferentes tejidos. Es la evidencia más directa de los niveles de expresión de proteínas. Para medir los niveles de expresión de proteínas, un requisito previo es el mismo número de muestras.

Sin embargo, evidentemente no es aconsejable utilizar la determinación de la concentración de proteínas como único método para estandarizar la equivalencia de tamaños de muestra entre varias muestras a comparar entre sí.

En primer lugar, varios métodos cuantitativos de concentración de proteínas tienen limitaciones y no pueden determinar de forma completa y precisa la concentración de proteínas de varias muestras. Por ejemplo, la cuantificación directa mediante métodos UV es adecuada para analizar proteínas con componentes relativamente puros y únicos. En comparación con el método colorimétrico, la operación es simple, pero es fácilmente interferida por sustancias paralelas como el ADN, tiene menor sensibilidad y requiere una mayor concentración de proteínas. Existen varios métodos para medir la concentración de proteínas mediante colorimetría, como el método BCA, el método Bradford y el método Lowry. Tanto el método BCA como el método Lowry son susceptibles a la interferencia de proteínas y detergentes. El método Bradford es el método más sensible. Es soluble en algunos agentes reductores que interfieren con la reacción de Laurie y BCA (como DTT y mercaptoetanol), pero sigue siendo sensible a los detergentes. Su principal desventaja es que diferentes estándares harán que los resultados de una misma muestra sean muy diferentes y no comparables. Además, después de la cuantificación de proteínas, se debe utilizar la misma cantidad de muestra para la electroforesis y también existen errores operativos en este paso. Los errores causados ​​por los pasos de cuantificación y carga se pueden corregir fácilmente utilizando controles internos en experimentos de Western Blot.

Cuando se utiliza un control interno en Western Blot, el anticuerpo correspondiente al control interno en el proceso WB en realidad se usa para detectar el control interno, de modo que la expresión del control interno y el producto objetivo puedan ser detectado al mismo tiempo. Dado que la expresión del control interno en varios tejidos y células es relativamente constante, el error de carga se puede corregir detectando la cantidad de control interno en cada muestra, lo que hace que los resultados semicuantitativos sean más creíbles. Además, la referencia interna se puede utilizar como control en blanco para detectar si la transferencia de proteínas está completa y si todo el desarrollo del color de Western Blot o el sistema de luminiscencia es normal.

2. ¿Cómo elegir la referencia interna adecuada?

Algunas personas optan por extraer las proteínas del citoplasma y del núcleo por separado, sin extraer la proteína total. La expresión de β-actina en el citoplasma es eficiente y estable. El componente principal de la proteína total es la proteína citoplasmática, por lo que la β-actina puede usarse como referencia interna para la proteína total. En teoría, la β-actina no se expresa en el núcleo y, por tanto, no puede utilizarse como referencia interna de proteína nuclear. De la misma manera, naturalmente no es razonable utilizar proteínas en el núcleo como referencia interna para la proteína total. Para ser convincente, la referencia interna debe seleccionar una proteína que tenga el mismo sitio de expresión que la proteína objetivo.

De hecho, sea cual sea el kit, es imposible separar completamente las proteínas citoplasmáticas y nucleares, y siempre habrá contaminación cruzada durante el proceso de extracción. En otras palabras, la proteína nuclear extraída definitivamente contendrá β-actina, y la proteína citoplasmática también contendrá proteína nuclear, por lo que se pueden obtener resultados utilizando ambas proteínas como referencias internas, pero algunas son científicas y razonables, y otras no son científicas. Sí, no convence.

Además, los anticuerpos de referencia internos de muchas empresas se preparan utilizando fragmentos de antígeno y diferentes empresas eligen fragmentos diferentes. Tomemos como ejemplo la β-actina más utilizada. Algunas empresas eligen el lado N y otras eligen el lado C. Las bandas de actina en el músculo cardíaco y estriado no pudieron detectarse con anticuerpos N-terminales. Las señales positivas para actina se pueden detectar en las células musculares mediante el uso de anticuerpos C-terminales. A veces se produce "especificidad de tejido" al detectar controles internos en experimentos, lo que se debe a una selección incorrecta de anticuerpos.

Entonces, cómo elegir una fuente de voltaje de referencia interna adecuada generalmente sigue los siguientes principios:

1) Fuente de las especies de muestra

Lo primero que hay que considerar es dónde la muestra experimental proviene de especies. Las muestras de células o tejidos de mamíferos suelen incluir β-actina, tubulina, GAPDH, lamina B, PCNA, Na/K-ATPasa, etc. Actina vegetal, Rubisco, etc. Se pueden seleccionar muestras experimentales de plantas.

Hay muy pocas muestras de otras fuentes, por lo que debe consultar la literatura para seleccionar una proteína adecuada como referencia interna.

2) Peso molecular de la proteína diana

A la hora de seleccionar anticuerpos de referencia internos, se debe considerar el peso molecular de la proteína diana. En términos generales, la diferencia de peso molecular entre la proteína objetivo y la proteína de referencia debe ser superior a 5 kD. Por ejemplo, cuando el peso molecular de la proteína diana es 45 KD, no es apropiado elegir β-actina (42 KD) como referencia interna. En su lugar, se puede considerar GAPDH (36 KD).

3) Sitio de expresión de la proteína diana

A. Proteínas citoplásmicas y de células completas: β-actina (43 KD), GAPDH (37 KD), tubulina (55 KD).

b.Nucleoproteínas: PCNA (29KD), histona H3 (17KD), etc.

c.Proteínas de la membrana nuclear: lámina B (66KD), etc.

d.Proteína de membrana: Na/K-ATPasa (120KD), etc.

Proteínas mitocondriales: COX IV (17KD), VDAC1 (30KD), etc.

4) Entorno experimental real

Algunas células tienen una expresión anormal de controles internos bajo ciertas condiciones, lo que las hace inadecuadas para su uso como controles internos. Por ejemplo, en algunas células, la expresión de GAPDH aumentará debido a factores como la hipoxia y la diabetes, por lo que no es adecuada como referencia interna. Lamin, etc. no son adecuados como referencias internas para experimentos de apoptosis. Cuando se añaden fármacos anticancerígenos y antifúngicos, la expresión de tubulina se ve afectada fácilmente y no es adecuada como referencia interna. La laminina B no es adecuada como referencia interna para células madre embrionarias y la PCNA no es adecuada como referencia interna para células no proliferativas. Por lo tanto, estos factores deben considerarse al diseñar protocolos experimentales y revisar la literatura correspondiente. Durante el experimento, si la expresión de la referencia interna es anormal, también se debe prestar atención a este factor.

5) Diferentes especificidades de los tejidos

La actina, o actina, es una proteína citoesquelética importante en las células. La actina se puede dividir aproximadamente en seis tipos, cuatro de los cuales son específicos de diferentes tejidos musculares, incluida la actina del músculo α-esquelético, la actina α-cardíaca, la actina del músculo liso α y la actina del músculo liso γ. Los otros dos están ampliamente distribuidos en varios tejidos, incluida la actina β (no muscular) y la actina γ no muscular. La distribución tisular de estas diferentes isoformas es diferente, la β-actina rara vez se distribuye en el tejido muscular y el músculo cardíaco está dominado por la α-actina cardíaca. Por lo tanto, diferentes organizaciones deben elegir diferentes parámetros internos y no pueden generalizarse.

3. ¿Cómo utilizar los parámetros internos en Western Blot?

El método de referencia interna utilizado en los experimentos de transferencia Western es el siguiente:

El uso de la referencia interna marcada es súper simple: simplemente agregue el anticuerpo de referencia interno marcado con HRP al incubar el segundo anticuerpo. (incubar el primer anticuerpo. No se agrega ningún anticuerpo, es decir, HRP está marcado directamente en el primer anticuerpo de la referencia interna) y simplemente seguir la operación normal.

Referencia interna común: cuando el peso molecular de la proteína objetivo no es muy diferente del peso molecular de la proteína de referencia interna seleccionada, la proteína objetivo se puede desarrollar y detectar mediante el desarrollo y la detección de la temperatura del anticuerpo. Luego use un tampón de tira para eliminar los anticuerpos de la membrana y realice nuevamente la incubación antitemperatura y la detección del color de la proteína de referencia interna.

Cuando el peso molecular de la proteína objetivo es significativamente diferente del peso molecular de la proteína de referencia seleccionada, la membrana se puede teñir previamente después de la transferencia y la membrana se puede cortar en pesos moleculares grandes y pequeños. partes según el tamaño del marcador proteico, para separar la proteína de referencia de la proteína objetivo. Luego, las dos membranas se incuban con anticuerpos contra la proteína de control interno y la proteína diana, respectivamente, y el segundo anticuerpo se incuba y desarrolla.