¿Cuál es el principio de PCR-RF-SSCP?

Autor: mark88 Fecha de envío: 9 de abril de 2006 0:39:00

Con el desarrollo de la tecnología de biología molecular, la detección de genes estructurales y siguen surgiendo enfoques mutacionales. Especialmente después de la llegada de la tecnología de PCR, se han combinado varias tecnologías de detección genética con la PCR, promoviendo aún más el desarrollo de la investigación genética, como la secuenciación directa de productos de PCR asimétricos, escisión de ribonucleasa, RNasa), polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y otras. Los métodos se han convertido en herramientas poderosas para el análisis genético, pero su funcionamiento es engorroso, tienen grandes limitaciones o tienen altos requisitos para las condiciones experimentales. No apto para laboratorios clínicos generales. PCR-SSCP (en adelante SSCP) es un método para detectar mutaciones genéticas que se introdujo en 1989. Después de la mejora y perfección continua, es más sencillo, más rápido y más sensible. No solo se utiliza para detectar mutaciones puntuales de genes y eliminaciones e inserciones de secuencias cortas, sino también para análisis cuantitativos de ADN, seguimiento de la contaminación cruzada en experimentos de diagnóstico por PCR e investigación de fuentes de infección. Debido a la investigación de SSCP,

1. Principios y características de SSCP

El japonés Orita y otros descubrieron que los fragmentos de ADN monocatenario se encuentran en una conformación de plegado espacial compleja. La estructura dimensional se da principalmente a través de las bases. Se mantienen interacciones intramoleculares como el apareamiento. Cuando una base cambia, afectará en mayor o menor medida a su conformación espacial, cambiando así la conformación. Por lo tanto, las moléculas de ADN monocatenarias con diferentes conformaciones espaciales se obstaculizan de manera diferente en los geles de poliacrilamida. La electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante (PAGE) puede separar moléculas con diferentes conformaciones de manera muy sensible. Los autores llaman a este método análisis de polimorfismo conformacional monocatenario (SSCP). En el siguiente estudio, el autor utilizó SSCP para detectar mutaciones genéticas en productos de amplificación por PCR, estableciendo así la tecnología PCR-SSCP, que mejoró aún más la simplicidad y sensibilidad del método de detección de mutaciones. El proceso básico es el siguiente. (2) Desnaturalizar el producto de amplificación por PCR específico y luego renaturalizarlo rápidamente para convertirlo en una molécula de ADN monocatenario con una determinada estructura espacial; ③ Tome una cantidad adecuada de ADN monocatenario y realice una electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante; ④ Finalmente use desarrollo radiactivo; , tinción de plata o resultados de análisis cromogénicos de bromuro de etidio. Si se descubre que la movilidad de una banda de ADN monocatenaria ha cambiado en comparación con el control normal, se puede juzgar que la estructura de la banda de ADN monocatenaria ha cambiado y entonces se puede inferir que hay una base mutación en el fragmento de ADN. Este método es sencillo, rápido, sensible, no requiere instrumentos especiales y es adecuado para experimentos clínicos. Sin embargo, también tiene algunas desventajas. Por ejemplo, solo se puede utilizar como método de detección de mutaciones y finalmente se debe determinar la ubicación de la mutación. Las condiciones de electroforesis son estrictas, además, dado que SSCP logra una separación electroforética basada en los cambios en la conformación tridimensional de las moléculas de ADN monocatenario causados ​​por mutaciones puntuales, puede ocurrir que las mutaciones puntuales en ciertas posiciones no tengan ningún efecto sobre los cambios; en la conformación tridimensional de moléculas de ADN monocatenario o cuando el impacto es muy pequeño, junto con otras condiciones, la electroforesis en gel de poliacrilamida no puede distinguir, lo que resulta en una detección perdida. Sin embargo, este método todavía tiene una tasa de detección más alta que otros métodos. En primer lugar, puede descubrir mutaciones de bases en ubicaciones desconocidas en fragmentos de ADN diana. Qiao Xiong demostró mediante experimentos que SSCP puede detectar el 90% de las mutaciones de una sola base en fragmentos de ADN de menos de 300 pb. Él cree que la mayoría de los cambios de base única conocidos pueden detectarse con este método. Además, el método SSCP puede separar ADN monocatenario mutante con diferentes movilidades mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y puede purificarse aún más. Mediante este método, los fragmentos de ADN mutados pueden finalmente identificarse a nivel de secuencia de ADN.

En segundo lugar, la mejora continua de SSCP

La tecnología SSCP ha experimentado un proceso de autodesarrollo y mejora desde su creación. Cuando se estableció por primera vez, los productos de amplificación por PCR se mezclaban con isótopos y los resultados se mostraban mediante autorradiografía, lo que provocó ciertas dificultades en la promoción de esta tecnología. Con la combinación de tinción de ADN con plata y PCR-SSCP, especialmente la aplicación de tinción directa con bromuro de etidio, este método se ha simplificado enormemente. Recientemente, una mejora significativa en SSCP fue el cambio del análisis de ADN-SSCP al análisis de ARN-SSCP.

El principio básico es que el ARN tiene conformaciones secundarias y terciarias más refinadas y es sensible a mutaciones de una sola base, lo que aumenta la tasa de detección, y la tasa de detección de mutaciones puede alcanzar más del 90%. Además, el ARN no se combina fácilmente en dobles hebras y se puede someter a electroforesis en grandes cantidades, lo que favorece la tinción con bromuro de etidio. Sin embargo, este enfoque mejora la tasa de detección. Se requieren cebadores más largos que contengan la secuencia de iniciación de la ARN polimerasa, lo que aumenta la dificultad de este enfoque.

Para mejorar aún más la tasa de detección de SSCP, el análisis de SSCP se puede combinar con otros métodos de detección de mutaciones. La combinación del análisis SSCP con el análisis híbrido (Het), que utiliza una sonda para hibridar con el ADN o ARN monocatenario que se va a detectar, puede mejorar enormemente la tasa de detección. Los híbridos que contienen un par de bases no coincidentes se pueden separar de los híbridos totalmente complementarios mediante electroforesis en gel de PAG nativo. Al realizar análisis SSCP y Het en la misma secuencia objetivo, la tasa de detección de mutaciones puntuales puede acercarse a 100 y el experimento es simple.

3. Funcionamiento experimental de PCR-SSCP

Cuando la longitud es inferior a 1Kb, la longitud del fragmento de ADN y la concentración de acrilamida se seleccionan de la siguiente manera:

La longitud del fragmento de ADN Longitud (número de nucleótidos) ()

1Kb~700b 3,5

700b~500b 5

500 b ~ 2008 b

200b 12

Antes de SSCP, los productos con buena especificidad deben amplificarse mediante PCR (la electroforesis en agarosa no debe tener colas demasiado fuertes).

1) Para preparar gel de poliacrilamida (PAG)

Prepare la solución de pegamento requerida de acuerdo con la tabla anterior, inserte el peine en el molde, agregue pegamento desde un extremo del peine, y cuando el pegamento cuando el líquido llegue a los dientes del peine, incline el molde hacia el extremo donde se agrega el pegamento, continúe agregando pegamento lentamente y coloque el molde del extremo mientras agrega para evitar la formación de burbujas. El curado a temperatura ambiente es 65438 ± 0. horas. Luego saque el peine y agregue 1×TBE en la parte superior para sellar y reservar.

2) Electroforesis

Tomar 10 μl de producto lpcr, agregar 10 μl de desnaturalizante (95 formamida, 10 mmol/LEDTA0.02 azul de bromofenol) y 30 μl de aceite de parafina, hervir durante 5 minutos y retirar inmediatamente. poner en un baño de hielo durante más de 2 minutos, luego tomar muestras de todas las fases del agua, 10-65. Luego realice la electroforesis a 120 V durante 8 horas, retire el gel, sumérjalo en 1 x tampón TBE que contenga 0,5 ug/ml de bromuro, tiña durante 30 a 45 minutos y observe con luz ultravioleta o tinción con plata.

3) Método de tinción con plata

Lavar la placa PAG dos veces con agua desionizada y sumergirla en una solución de etanol 10 y ácido acético glacial 0,5 durante 6 minutos. Lavar dos veces con agua desionizada y luego sumergir en solución de 0,2AgNO3 durante 65438±00 minutos. Enjuague con agua desionizada 3-5 veces, luego sumerja en una solución de NaOH 1,5 y formaldehído 0,4 durante 7 minutos.

En cuarto lugar, la aplicación de SSCP

Desde que Orita et al. utilizaron SSCP para analizar polimorfismos del ADN humano, este método se ha utilizado ampliamente para detectar mutaciones genéticas relacionadas con la tumorigénesis, como p53. mutaciones genéticas en astrocitomas, tumores cerebrales, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer gástrico, cáncer intestinal y otros tumores, mutaciones del gen ras en cáncer de pulmón, etc. Recientemente, Sugano et al. utilizaron el método SSCP de tinción con plata para detectar con éxito la mutación de 12 sitios del gen c-Ki-ras2. Los procesos de electroforesis y tinción con plata se completaron en 2,5 horas. SSCP también se utiliza para detectar enfermedades genéticas en humanos, como el gen CFTR, el gen de la neurofibromatosis 1 y el gen de la poliposis familiar del colon, que desempeñan un papel en la fibrosis quística. Recientemente, Sharkar et al. utilizaron RNA-SSCP para detectar la secuencia genética del factor IX de coagulación en 28 pacientes con hemofilia B y la compararon con DNA-SSCP y la secuenciación directa de genes. Se descubrió que el genoma del factor de coagulación ⅸ tiene 20 mutaciones de punto base, con una longitud completa de 2,6 kpb, de las cuales RNA-SSCP puede detectar 70 y DNA-SSCP solo puede detectar 35, lo que indica que RNA-SSCP es mejor que DNA- SSCP.

El método SSCP no sólo se utiliza ampliamente en la detección de mutaciones genéticas, sino también en el estudio de la tipificación de virus, el seguimiento de la contaminación en experimentos de PCR y las rutas de transmisión de patógenos. Yap utiliza PCR anidada para detectar estándares de VHB de diferentes países y regiones, y realiza análisis SSCP en los productos amplificados. Se descubrió que los patrones de SSCP de cada muestra eran completamente diferentes, lo que no solo demostró la existencia de una variación regional en el ADN del VHB, sino que también eliminó la posibilidad de contaminación cruzada y encontró una buena manera de garantizar la confiabilidad de los resultados de diagnóstico por PCR. . Además, Yap et al. también utilizaron SSCP para el análisis cuantitativo de ADN. Combinaron SSCP con PCR competitiva para analizar cuantitativamente las mutaciones del gen p53 en células de cáncer de mama y lograron el éxito inicial. La ventaja de este método es que sólo hay una diferencia de base entre el estándar interno y el ADN a analizar. De esta forma, el estándar interno y el ADN a analizar tienen las mismas condiciones de amplificación, por lo que se puede medir la cantidad de ADN con mayor precisión. En resumen, SSCP juega un papel muy importante en el campo de la biología molecular.

Precauciones verbales (abreviatura de verbo) para el SSCP

SSCP es un método rápido, sencillo y sensible para detectar mutaciones genéticas. Para lograr los mejores resultados de SSCP, debemos prestar atención a lo siguiente.

① Repetibilidad. Los principales factores que afectan la repetibilidad de SSCP son el voltaje y la temperatura de la electroforesis. Cuando estas dos condiciones permanecen sin cambios, el mapa SSCP puede mantener una buena repetibilidad. Los patrones SSCP generalmente muestran dos bandas de ADN monocatenario, pero a veces algunos fragmentos de ADN pueden mostrar solo una banda SSDNA o tres o más. Esto se debe principalmente a la similitud en la conformación tridimensional entre los dos ADN monocatenarios. A veces, más de tres patrones SSCP son el resultado de la coexistencia de fragmentos de ADN de tipo salvaje y fragmentos de ADN mutantes.

②La influencia de la longitud de la secuencia del ADN objetivo. En experimentos, se encontró que la tasa de detección de mutaciones puntuales en ADN o ARN de cadena corta mediante SSCP es mayor que la del ADN o ARN de cadena larga. Esto puede deberse al hecho de que se producen cambios en bases individuales en la cadena larga. Las moléculas de ADN y ARN tienen poco efecto en el mantenimiento de la conformación tridimensional. Algunas personas creen que cuando la cadena de ADN es muy corta (menos de 400 pb), la longitud del ADN no afectará el efecto del SSCP. Seleccionaron cuidadosamente las condiciones experimentales y descubrieron que la tasa de detección de mutaciones puntuales en el ADN de 354 pb aún podría alcanzar el 90%.

③La influencia del voltaje y la temperatura de la electroforesis: para mantener una conformación tridimensional estable del ADN monocatenario, la SSCP debe realizarse a una temperatura relativamente baja (generalmente entre 4 ℃ ~ 15 ℃). Además de la temperatura ambiente, el voltaje excesivo también es la principal causa del aumento de temperatura durante la electroforesis. Por lo tanto, al realizar SSCP en un tanque de electroforesis sin dispositivo de enfriamiento, se debe aplicar un voltaje más alto (250 V) durante los primeros 5 minutos. En el futuro, la electroforesis utilizará un voltaje de aproximadamente 100 V. Esto se debe principalmente a que el alto voltaje inicial puede separar ADN monocatenario con diferentes conformaciones tridimensionales, pero la temperatura del gel no aumentará. La electroforesis posterior de bajo voltaje puede separarlo aún más. El voltaje de electroforesis debe determinarse de acuerdo con las condiciones experimentales específicas del experimento.

(4) El impacto de la posición de las mutaciones puntuales en los fragmentos de ADN en el SSCP El impacto de la posición de las mutaciones puntuales en el ADN y el ARN en la tasa de detección de SSCP depende del papel de la posición en el mantenimiento. la conformación tridimensional, no solo depende únicamente de la posición de la mutación puntual en la cadena de ADN (algunos argumentan que es más probable que SSCP detecte mutaciones puntuales en el medio de la cadena de ADN que en el extremo proximal). White diseñó un conjunto de fragmentos de ADN de muestra. Las mutaciones puntuales se encuentran en el medio de la cadena de ADN, con el punto del bucle en la parte superior de la estructura en horquilla. Se descubrió que SSCP solo pudo detectar 2 de 9 muestras (tasa de detección 22), lo que indica que las mutaciones en cualquier parte de la cadena de ADN pueden pasar desapercibidas siempre que no tengan ningún efecto en su conformación monocatenaria.

⑤Los resultados de SSCP muestran que en el análisis SSCP, la electroforesis de PAG no desnaturalizante no se basa en el tamaño y la carga de las moléculas de ADN monocatenario, sino en el impedimento estérico de la conformación espacial del ADN monocatenario. fragmentos, por lo que esta separación no refleja el peso molecular. A veces, la movilidad de las hebras normales y mutantes es muy parecida. Es difícil notar la diferencia entre los dos.

Por lo tanto, generalmente se requiere que la longitud de la electroforesis sea superior a 16-18 cm, y el límite de detección es la diferencia mínima entre la distancia de electroforesis del fragmento de ADN mutante y el fragmento de ADN normal. Si es mayor que el límite de detección, se considera una cadena.