¿Cuáles son los pasos y precauciones clave durante la extracción de ADN?

1. Tome 100ul-200ul de tejido muscular fresco o congelado o 0,05 g de tejido de muestra conservado con 95ALC. 2. Corte la mayor cantidad de tejido posible y colóquelo en tubos de centrífuga de 1,5 ml.

3. Añadir 450 microlitros de tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 8,0; EDTA 100 mM, pH 8,0)

4 Añadir 10 SDS 50-100 a cada tubo ul. (70-80 variable) (1-2), luego añadir 2,5-5 ul (3 ul) de proteinasa K (20 mg/ml).

La concentración final es de 100 ug/ml. La mezcla se agita uniformemente a 55 °C durante 3 horas hasta toda la noche (el tubo de ensayo se invierte varias veces durante este período). 5. Agregue 150 ul de NaCl (sal) a la muestra, centrifugue a temperatura ambiente a 8000 rpm durante 20 minutos, retire el precipitado y luego agréguelo al sobrenadante.

Añadir el mismo volumen (500ul) de alcohol isopropílico preenfriado (ADN precipitado), mezclar bien, tratar a 20°C durante 30 minutos, centrifugar a 65438±04000 rpm durante 65438±00 minutos y eliminar el sobrenadante. El precipitado se lavó con 70 ALC y se centrifugó para eliminar ALC. Evaporar ALC a temperatura ambiente durante 5-10 minutos, agregar 500 ul Te ​​​​y 10 ul RNasa (concentración final 4 mg/ul), es decir, 2,5 ul a 37 ℃ durante 30 min o 65 ℃ durante 15 min.

6. Agregue un volumen igual de solución ácida (para extraer proteínas del ADN) y gire lentamente el tubo de centrífuga hacia adelante y hacia atrás durante 65,438 ± 00 minutos, y centrifugue a 13000-15000 rpm.

10 minutos Utilice una pipeta (punta grande) para retirar con cuidado la fase superior y colóquela en otro tubo de centrífuga limpio sin tocar la capa de proteína blanca entre las dos fases (repita según convenga varias veces). 7. Agregue volúmenes iguales de fenol:cloroformo (para extraer fenol) (1:1), agite suavemente, invierta lentamente para mezclar y centrifugue a 13000-15000 rpm durante 10 minutos.

Después de 5-10 minutos, llevar el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio.

8. Añade un volumen igual de cloroformo (cloroformo:alcohol isoamílico (para evitar que el cloroformo se volatilice) = 24:1), agita suavemente, invierte lentamente y mezcla.

Centrifugar a 13000-15000 rpm durante 5-10 minutos. Añadir 1/10 de volumen de NaCl 2 M y un volumen igual de etanol absoluto (o un volumen igual de alcohol isopropílico) almacenado a -20°C (ADN precipitado) al sobrenadante, precipitar el ADN durante 10 minutos y centrifugar a 13000 rpm. durante 5 minutos, retirar el sobrenadante, añadir 100-10. Secar a 45°C durante 15-30 minutos, lavar con agua bidestilada a lo largo de la pared del tubo (el contenido de TE depende de la cantidad de precipitación de ADN, entre 80-250ul). ), disolver durante 12-24 h, almacenar a -20°C para su uso posterior.

Notas:

1. La solución de lisis debe precalentarse para inhibir la desoxirribonucleasa, acelerar la desnaturalización de proteínas y promover la disolución del ADN.

2. El fenol debe estar equilibrado por los álcalis. El fenol es altamente corrosivo y puede causar daños si salpica la piel, las membranas mucosas y los ojos. Preste atención a la protección. El cloroformo es inflamable, explosivo y volátil, y tiene efectos neurotóxicos, por lo que se deben tomar precauciones al manipularlo.

3. Cada paso de la operación debe ser suave para minimizar la degradación artificial del ADN.

4. Al tomar el sobrenadante, no tome demasiado para evitar interferencias de componentes no ácidos nucleicos.

5. Alcohol isopropílico, etanol, NaAc, KAc, etc. Debe enfriarse previamente para reducir la degradación del ADN y promover la separación de fases del ADN y las proteínas y la precipitación del ADN.

6. Los reactivos y equipos utilizados en el proceso de extracción de ADN deben secarse a alta presión sin adición de nucleasa.

7. Todos los reactivos se preparan con agua bidestilada en autoclave.