Pasos experimentales para la detección de luminiscencia ECL en experimentos de transferencia Western

El kit de detección de luminiscencia específico ECL West se utiliza para detectar proteínas o ácidos nucleicos marcados con peroxidasa de rábano picante (HRP). A continuación se utiliza el líquido luminiscente ECL ultrasensible Enlight-Plus de engreen como ejemplo para describir los pasos experimentales de detección.

1. Electroforesis convencional, transferencia de membrana, incubación de sonda de ácido nucleico o anticuerpo marcado con HRP y lavado de membrana. Las siguientes operaciones se realizan a temperatura ambiente.

Nota: La dilución de anticuerpos recomendada por Enlight-Plus es:

La dilución recomendada del anticuerpo primario con una concentración de solución de conservación de 1 mg/ml y del anticuerpo secundario con una solución de conservación concentración de 1 mg/ml Dilución recomendada.

1:1000-1:5000 o 0,2-1,0 microgramos/ml 1:2000-1:10.000 o 10.

2. Fluido de trabajo luminoso recién preparado. Mezcle BufferA y Buffer B en una proporción de 1:1 para obtener una solución de trabajo luminiscente (se requieren 0,125 ml de solución de trabajo luminiscente por cada pieza de 1 cm2). Transfiera a una caja de plástico limpia.

3. Utilice unas pinzas para sacar la membrana enjuagada y toque suavemente el borde inferior de la membrana con papel de filtro para eliminar el exceso de líquido de lavado en la membrana, pero no la seque por completo. Transfiera la membrana a una caja de plástico que contenga una solución de trabajo luminiscente, remójela completamente, agite suavemente e incube a temperatura ambiente durante decenas de segundos a 1 minuto.

4. Utilice unas pinzas para sujetar la película durante 5 a 10 segundos, toque suavemente el borde inferior de la película con papel de filtro, elimine el exceso de líquido luminiscente de la película y envuélvala rápidamente con una envoltura de plástico limpia. para eliminar las burbujas de aire. Doble y asegúrelo en el casete de rayos X, con la albúmina hacia arriba.

5. Coloque tres películas de rayos X a la vez en la oscuridad y sáquelas para revelarlas después de más de 30 minutos.

6. Realizar una hibridación multiproteína en la misma membrana: lavar la solución luminiscente con PBST o TBST (10 min × 3 veces) y luego realizar una hibridación primaria de anticuerpos desde el principio.

La elección de la solución luminiscente ECL en Western-blot es muy importante. El nivel de detección de Enlight-Plus puede alcanzar el nivel de pg, con un tiempo luminoso prolongado y un fondo bajo. La imagen resultante es muy hermosa, lo cual es muy beneficioso para el experimento.