Clasificación de sondas de ARN
Varias sondas de ARN comunes y sus características:
La sonda de ARN se refiere a una cadena única marcada que puede unirse de forma complementaria a la secuencia de nucleótidos correspondiente en el tejido. Las sondas utilizadas en la hibridación de ARN se pueden dividir en tres tipos según sus fuentes: ADNc específico, sondas de ARNc y sondas de oligonucleótidos sintéticos. Sonda de ARNc: Se obtiene mediante transcripción in vitro utilizando ADNc como plantilla. Debido a que es una sonda monocatenaria, también evita el problema de renaturalización entre las dos líneas cuando se utilizan sondas de ADNc bicatenario para reacciones de hibridación. El híbrido formado entre ARNc y ARN es más estable que el híbrido ADNc-ARN. El híbrido formado entre ARNc-ARN no se ve afectado por la RNasa. Por lo tanto, se puede utilizar el tratamiento con RNasa después de la reacción de hibridación para eliminar la sonda no unida. Debido a que las sondas de ARNc tienen las ventajas anteriores y el nivel de saturación de hibridación de las sondas de ARNc es ocho veces mayor que el de las sondas de ADN bicatenario, se utilizan ampliamente en la hibridación in situ. Las desventajas de las sondas de ARNc son: el proceso de preparación de la sonda es relativamente complicado y requiere un mejor equipo experimental de biología molecular. Es sensible a la RNasa y se daña fácilmente. Tenga cuidado para evitar la contaminación por RNasa. Sonda de ADNc monocatenario: dado que no hay intrones ni otras secuencias altamente repetitivas en el ADNc, supera las deficiencias de las sondas de ADNc bicatenario en la renaturalización entre las dos cadenas en la reacción de hibridación, mejorando así la sensibilidad de la reacción de hibridación. . Sin embargo, debido a la dificultad para preparar sondas de ADNc monocatenarias, rara vez se ha utilizado en la hibridación in situ de ARN. Sondas de oligonucleótidos: Las sondas de oligonucleótidos sintéticas están hechas de nucleótidos y sintetizadas mediante un sintetizador de ADN, lo que evita los efectos adversos de secuencias altamente repetitivas presentes en las células eucariotas. Dado que la mayoría de las secuencias de oligonucleótidos son cortas y no requieren purificación, tienen una excelente penetración en los tejidos. Las sondas diseñadas en función de la secuencia específica del gen diana tienen una gran especificidad. Las desventajas de las sondas de oligonucleótidos sintéticos son: la longitud de la sonda debe ser adecuada. Las sondas que son demasiado largas pueden provocar una hibridación incorrecta y las sondas que son demasiado cortas pueden formar una unión no específica. El híbrido que forma con ARNm no es tan estable como el híbrido ARNc-ARN. Además, la sonda es más corta, lleva menos marcadores y es menos sensible. Cabe mencionar que cambiando la dirección de inserción de genes extraños o usando diferentes ARN polimerasas, se puede controlar la dirección de la transcripción del ARN, es decir, qué cadena de ADN se utiliza como plantilla para transcribir el ARN. Esto puede producir sondas de ARN sinónimas (la misma secuencia que el ARNm) y sondas de ARN antisentido (complementarias del ARNm). El ARN antisentido también se denomina ARNc. Además de usarse para la investigación de ácidos nucleicos antisentido, también se puede usar para detectar la expresión de. nivel de ARNm. En este caso, debido a que tanto la secuencia sonda como la diana son monocatenarias, la hibridación es varios órdenes de magnitud más eficiente que la hibridación ADN-ADN. Además de usarse para detectar ADN y ARNm, las sondas de ARN también tienen un propósito importante al estudiar la expresión genética, a menudo es necesario observar el estado de transcripción del gen. En los sistemas de expresión procarióticos, los genes exógenos no sólo se transcriben directamente, sino que a veces se transcriben de forma inversa (es decir, se genera ARN antisentido). Este fenómeno es a menudo una razón importante para la baja expresión de genes exógenos. Además, en los sistemas eucariotas, algunos genes también se someten a transcripción inversa para producir ARN antisentido, que participa en la regulación de su propia expresión. En estos casos, para medir con precisión los niveles de transcripción directa e inversa, no se pueden utilizar sondas de ADN bicatenario, sino que sólo se pueden utilizar sondas de ARN o sondas de ADN monocatenario.