La banda del experimento wb es (¿debe ser más delgada que la referencia interna?
Por lo tanto, se necesita un buen sistema de referencia en el diseño experimental estricto de transferencia Western, que sea muy útil para el análisis de resultados experimentales. Especialmente cuando hay un problema en el experimento, es fácil encontrar el problema con la ayuda del sistema de referencia, sin rascarse la cabeza ni quejarse. Un buen sistema de referencia suele incluir marcadores de peso molecular (utilizados para determinar el peso molecular correspondiente a las bandas de proteínas), controles de vector en blanco (si es un sistema de expresión inducida, debe haber controles antes de la inducción), controles positivos de cantidades conocidas de estándares; y referencia interna. Sin embargo, debido a limitaciones financieras o pereza, muchas personas en China a menudo omiten referencias al realizar Western Blot, lo que resulta en la incapacidad de analizar los resultados cuando hay problemas; incluso si hay resultados, puede afectar el análisis de los resultados. Los parámetros internos son el elemento que más fácilmente se pasa por alto.
Sabemos que Western Blot se puede utilizar para comparar la expresión relativa de proteínas diana en diferentes condiciones o en diferentes tejidos. La premisa es que se carga la misma cantidad de células, de modo que se pueda establecer la base de comparación. ser obtenido. Especialmente cuando los niveles de expresión no son altos, es probable que las diferencias en el tamaño de la muestra afecten el análisis de los resultados. Entonces necesitas parámetros internos. La referencia interna se refiere al control interno, que generalmente se refiere a la proteína constitutiva codificada y expresada por el gen constitutivo en células de mamífero. Su expresión es relativamente constante en diversos tejidos y células y, a menudo, se utiliza como referencia para detectar cambios en los niveles de expresión de proteínas. En el experimento de transferencia Western, además de la extracción de proteínas, la cuantificación de proteínas, la electroforesis de carga de proteínas, la transferencia de membrana, la incubación de anticuerpos de proteínas diana, el desarrollo del color y otros pasos, también es necesario detectar controles internos para corregir errores experimentales durante la cuantificación y carga de proteínas. Garantizar la exactitud de los resultados experimentales.
En artículos publicados en el extranjero se ha convertido en una práctica común que los resultados de los experimentos de Western Blotting deben corregirse con parámetros internos. Sin embargo, todavía hay muchos investigadores nacionales que ignoran el uso de controles internos en los experimentos de transferencia Western y consideran la determinación de la concentración de proteínas como la única forma de estandarizar la equivalencia del volumen de muestra entre varias muestras que deben compararse entre sí. Sin embargo, varios métodos de cuantificación de la concentración de proteínas tienen limitaciones y no pueden determinar con total precisión la concentración exacta de proteínas de varias muestras. Por ejemplo, los métodos UV son adecuados para detectar proteínas puras y relativamente únicas. En comparación con el método colorimétrico, el funcionamiento es sencillo, pero es susceptible a la interferencia de sustancias paralelas, como el ADN. La sensibilidad es baja y la concentración de proteínas requerida es alta. Existen varios métodos para medir la concentración de proteínas mediante colorimetría, como el método BCA, el método Bradford y el método Lowry. Tanto el método BCA como el método Lowry son susceptibles a la interferencia de proteínas y detergentes. El método Bradford tiene la mayor sensibilidad y es compatible con una variedad de agentes reductores que interfieren con las reacciones de Lowry y BCA, como DTT y mercaptoetanol. Sin embargo, sigue siendo relativamente sensible a los detergentes. La principal desventaja es que diferentes estándares harán que los resultados de la misma muestra sean muy diferentes, lo que los hará incomparables.
Además, después de la cuantificación de proteínas, es necesario cargar la misma cantidad de muestra para la electroforesis, y también existen errores operativos en este paso. El uso de controles internos en experimentos de transferencia Western puede corregir fácilmente los errores causados por los pasos de cuantificación y carga. Cuando se utiliza un control interno en Western Blotting, en realidad se utiliza el anticuerpo correspondiente al control interno para detectar el control interno durante el proceso de WB, de modo que la expresión del control interno y el producto objetivo se puedan detectar al mismo tiempo. Dado que la expresión del control interno en varios tejidos y células es relativamente constante, el error de carga se puede corregir detectando la cantidad de control interno en cada muestra, lo que hace que los resultados semicuantitativos sean más creíbles. Además, la referencia interna se puede utilizar como control en blanco para detectar si la transferencia de proteínas está completa y si todo el desarrollo del color de Western Blot o el sistema de luminiscencia es normal.
El análisis de los resultados experimentales es realmente muy simple: si la cantidad de proteína en la muestra es limitada, al realizar un experimento de membrana de transferencia de electroforesis, es suficiente detectar los parámetros internos y la cantidad de objetivo. proteína en la muestra.
Divida la cantidad de proteína objetivo en cada muestra por su contenido de referencia interna. El valor obtenido es el contenido relativo de la proteína objetivo en cada muestra después de la corrección de referencia interna. Este valor se utiliza para realizar análisis comparativos de las muestras para obtener el objetivo. contenido de proteína entre diferentes muestras resultados de cambios reales. Si el tamaño de la muestra es suficiente, primero puede probar la referencia interna, observar si las bandas de color de la referencia interna son consistentes entre las muestras, ajustar el tamaño de la muestra de cada muestra de acuerdo con la diferencia y realizar el experimento de transferencia Western nuevamente hasta que la referencia interna es consistente; si la referencia interna es consistente, se pueden analizar diferentes muestras de cambios de expresión de la proteína objetivo. Aunque esto es un poco problemático, puede garantizar que los resultados sean más convincentes y creíbles. Después de todo, nuestro experimento es una tarea rigurosa.
Adjunto: El método para usar la referencia interna en experimentos de transferencia Western es el siguiente:
1. El uso de la referencia interna marcada es súper simple: agregue el anticuerpo de referencia interna marcado con HRP durante el proceso. el proceso de incubación de anticuerpos secundarios Simplemente siga las operaciones normales.
2. Referencia interna ordinaria: cuando el peso molecular de la proteína objetivo no es muy diferente del de la proteína de referencia interna seleccionada, se puede realizar primero el desarrollo de la temperatura del anticuerpo y la detección de la proteína objetivo. Luego use un tampón de tira para eliminar los anticuerpos de la membrana y realice nuevamente la incubación antitemperatura y la detección del color de la proteína de referencia interna.
3. Cuando el peso molecular de la proteína objetivo es significativamente diferente del peso molecular de la proteína de referencia seleccionada, se puede realizar una tinción previa después de transferir la membrana y la membrana se puede cortar en moléculas grandes. peso y peso molecular pequeño según el tamaño de la parte del marcador de proteína para separar la proteína de referencia de la proteína objetivo. Luego, las dos membranas se incuban con anticuerpos contra la proteína de control interno y la proteína diana, respectivamente, y el segundo anticuerpo se incuba y desarrolla.