¿Qué papel juegan los cebadores de ARN en la replicación del ADN?

Ácido ribonucleico (ARN para abreviar)

Ácido ribonucleico

Un tipo de ácido ribonucleico compuesto por al menos docenas de ribonucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster. El ácido nucleico formado se llama ARN para abreviar porque contiene ribosa. El ARN se encuentra comúnmente en animales, plantas, microorganismos y algunos virus y bacteriófagos. El ARN está estrechamente relacionado con la biosíntesis de proteínas. En los virus de ARN y los bacteriófagos, el ARN es el portador de información genética. El ARN es generalmente una molécula lineal monocatenaria; también hay ARN bicatenarios como los reovirus; en 1983 también se descubrieron ARN monocatenarios circulares como las moléculas de ARN viroide;

Estructura

En 1965, R.W. Hawley y otros determinaron la estructura primaria de 1 ácido nucleico: ácido ribonucleico de transferencia de alanina de levadura, es decir, la secuencia de nucleótidos. Desde entonces, la determinación de la estructura primaria del ARN se ha desarrollado rápidamente. En 1983, había más de 280 tipos de ARNt de diferentes fuentes y que aceptaban diferentes aminoácidos, incluidos 175 tipos de ARN 5s y docenas de ARN 5,8S, así como muchos ARNr 16S, ARNr 18S, ARNr 23S y ARNr 26S. En términos de ARNm, también se han dilucidado el ARNm de globina de mamíferos, el ARNm de ovoalbúmina de pollo y el ARNm de muchas hormonas proteicas y enzimas. Además, también se determinaron las secuencias de nucleótidos de algunos ARN pequeños, como el ARNsn y el ARN producido después de una infección viral. El ARN similar a un virus también tiene cinco estructuras primarias conocidas, todas las cuales son hebras simples circulares. El ARN de MJS2, el ARN del virus del mosaico del tabaco y el ARN del poliovirus son ARN relativamente grandes con estructuras conocidas.

Además de la estructura primaria, también existen bases (A a U; la estructura secundaria formada por g versus c). La estructura terciaria del ARN, de la cual el ARNt es el más claramente estudiado. ARNt, 1974, estudio de difracción de rayos X de cristales de ARNt de fenilalanina de levadura confirmó que su estructura tridimensional tiene forma de L invertida (ver transferencia de ácido ribonucleico).

La estructura primaria del ARN a menudo se determina mediante el uso de algunas enzimas herramienta específicas de base para degradar el ARN en oligonucleótidos y luego descomponerlo de forma cruzada basándose en dos (o más) enzimas herramienta diferentes. Como resultado, se mide la porción superpuesta, determinando así la estructura primaria del ARN. Los ejemplos son los siguientes:

Aguge

Pico de ribonucleasa pancreática bovina amilasa ribonucleasa T1

(ribonucleasa A)(ribonucleasa T1)

AGU +C+GGU+AG AG+UCG+G+UAG

La ribonucleasa pancreática bovina es una endonucleasa que se une al 3'- de los nucleótidos de pirimidina. Escinde específicamente entre el fosfato y el grupo 5'-hidroxilo de. su nucleótido adyacente, por lo que se utiliza para descomponer el nucleótido AGUCGGUAG9 antes mencionado para obtener cuatro productos: AGU, C, GGU y AG. Sin embargo, la RNasa T1 es una endonucleasa que escinde específicamente el 3'-fosfato del guanilato y el grupo 5'-hidroxilo de su nucleótido adyacente. Cuando actúa sobre los 9 nucleótidos anteriores se obtienen los productos AG, UCG, G y UAG4. Según la naturaleza del producto se puede disponer la estructura primaria de 9 nucleótidos.

Además de las dos ribonucleasas anteriores, también existe una ribonucleasa de polvo de carbón (RNasa U2), que escinde específicamente el adenilato y el guanilato y se puede combinar con la ribonucleasa pico de amilasa. La enzima T1 se usa en combinación para determinar la Posición del adenilato en el ARN. Los dinucleótidos de la ribonucleasa de Rhizoctonia polycephalum (RNasa Phy) se pueden hidrolizar rápidamente excepto CpN, por lo que la combinación de RNasa y ribonucleasa pancreática bovina puede distinguir las posiciones de Cp y Up en el ARN.

Funciones y tipos biológicos En la década de 1940, se observó mediante citoquímica y espectroscopia celular ultravioleta que el contenido de proteínas en los tejidos ricos en ARN también era alto, y se especuló que el ARN estaba relacionado con la biosíntesis de proteínas. Hay tres tipos de ARN implicados en la biosíntesis de proteínas: ácido ribonucleico de transferencia (ARNt), ácido ribonucleico mensajero (ARNm) y ácido ribonucleico ribosómico (ARNr).

Los diferentes ARN tienen diferentes funciones.

Entre ellos, el ARNr es un componente de los ribosomas y es sintetizado por el nucléolo en el núcleo, mientras que el ARNm realiza diferentes funciones en diferentes etapas de la síntesis de proteínas.

El ARNm es una cadena única transcrita basándose en el principio de emparejamiento de bases complementarias utilizando una cadena de ADN como plantilla. Su función principal es realizar la expresión de la información genética en proteínas y es un puente en el proceso de transmisión de la información genética.

La función del ARNt es transportar los aminoácidos necesarios y conectarlos en cadenas peptídicas, que luego se procesan para formar proteínas.

Para más detalles, consulte el segundo volumen de biología de la escuela secundaria, la sección genética.

ARN se refiere al ácido ribonucleico.

Cadena larga y no ramificada formada por la polimerización de ribonucleótidos. De menor peso molecular que el ADN, pero más abundante que el ADN en la mayoría de las células. Hay tres tipos principales de ARN: ARN mensajero (ARNm), ARN ribosómico (ARNr) y ARN de transferencia (ARNt). Los tres tipos de moléculas de ARN son monocatenarios, pero difieren en peso molecular, estructura y función.

En los virus de ARN, el ARN es el material genético, y los virus de plantas siempre contienen ARN. En los últimos años, se han descubierto en las plantas algunos agentes causantes de enfermedades infecciosas que son mucho más pequeños que los virus, llamados viroides. Los viroides son moléculas de ARN monocatenario de circuito cerrado sin proteínas. Además, hay dos tipos de ARN en las células eucariotas, a saber, el ARN nuclear heterólogo (hnRNA) y el ARN nuclear pequeño (snRNA). El HnRNA es el precursor del mRNA; el SnRNA participa en el empalme del hnRNA (un proceso de procesamiento). Desde que se determinó la secuencia de bases del ARNt de alanina de levadura en 1965, los métodos para la secuenciación del ARN se han mejorado continuamente. En la actualidad, además de varios ARN más pequeños, como ARNt, 5SrRNA y 5.8SrRNA, se ha completado la determinación de la estructura primaria de algunos ARN virales, ARNm y ARN más grandes. Por ejemplo, el ARN del bacteriófago MS2 contiene 3569 nucleótidos.

Tipos de ARN:

Encontradas en los organismos, tres moléculas de ARN diferentes desempeñan funciones importantes en el proceso de expresión genética. Son ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt) y ARN (el ARN ribosomal (ARNr) contiene cuatro bases básicas, a saber, adenina, guanina, citosina y uracilo. p>

La estructura primaria del ARN se compone principalmente de cuatro nucleótidos, AMP, GMP, CMP y UMP, que están conectados por enlaces fosfodiéster 3', 5'. La estructura secundaria del ARN natural no es una doble hélice como el ADN. , pero puede plegarse en múltiples secciones, lo que hace que algunos pares de bases A-U y G-C formen regiones helicoidales cortas e irregulares que se expanden para formar bucles y quedan excluidos de la doble hélice. El factor estabilizador de la estructura de doble hélice en el ARN es principalmente el. fuerza de apilamiento de bases, seguida de enlaces de hidrógeno. Cada región de doble hélice requiere al menos de 4 a 6 pares de bases para permanecer estable. En el ARN, la proporción de regiones de doble hélice es diferente. , ARNr y ARNt En la mayoría de las células, el contenido de ARN es 5 veces mayor que el de ADN ~ 8 veces. Características del ARN de Escherichia coli

ARN mensajero

La información genética de los organismos. se almacena principalmente en la secuencia de bases del ADN, pero el ADN no determina directamente la síntesis de proteínas. En las células eucariotas, el ADN se almacena principalmente en los cromosomas dentro del núcleo, mientras que el sitio de síntesis de proteínas existe en los ribosomas en el citoplasma. Se necesita una sustancia intermedia para transferir la información genética que controla la síntesis de proteínas del ADN a la ribosa. Se ha demostrado que este intermediario es un tipo especial de ARN que transmite información genética, por eso se llama ARN (ARN mensajero (ARNm). ).

La función del ARNm es transferir información genética. La información genética se transcribe con precisión en el ADN, y luego la secuencia de bases del ARNm determina la secuencia de aminoácidos de la proteína, completando así el proceso de transmisión de información genética durante la expresión génica, el ARN precursor formado por transcripción contiene una gran cantidad de secuencias no codificantes, de las cuales solo alrededor del 25% se procesa en ARNm y finalmente se traduce en proteína. -ARNm) varía mucho en tamaño molecular, a menudo se le llama ARN nuclear heterólogo (HNRNA).

ARNt

Si el ARNm es el modelo para la síntesis de proteínas, entonces los ribosomas son las fábricas. para la síntesis de proteínas.

Sin embargo, existe una falta de afinidad específica entre los 20 aminoácidos, los componentes básicos de la síntesis de proteínas y las bases del ARNm. Por lo tanto, se debe utilizar un tipo especial de ARN (ARN de transferencia (ARNt)) para transportar aminoácidos al ribosoma. El ARNt puede conectar con precisión los aminoácidos transportados por el ARNm para formar una cadena polipeptídica de acuerdo con el código genético. Cada aminoácido puede unirse a entre 1 y 4 ARNt y se conocen más de 40 ARNt.

El ARNt es el ARN más pequeño, con un peso molecular medio de unos 27.000 (25.000-30.000) y compuesto por 70 a 90 nucleótidos. Y tiene las características de bases raras. Además de pseudouridina y nucleósidos de hipoxantina, se trata principalmente de purinas y pirimidinas metiladas. Estas bases raras generalmente se crean mediante modificaciones especiales después de la transcripción.

Desde 1969, se han estudiado las estructuras de más de una docena de ARNt de levadura, E. coli, trigo, ratones y otros organismos, demostrando que sus secuencias de bases pueden plegarse en estructuras secundarias en forma de trébol. (Figura 3-23), y todos tienen las siguientes * * * características:

① Hay g (principalmente) o c en el extremo 5'.

②El extremo de 3' termina en orden ACC.

③Hay un anillo rico en guanina.

④ En la parte superior de este anillo hay un anillo anticodón con tres bases expuestas, llamados anticodones. Los anticodones pueden emparejarse con codones complementarios en la cadena de ARNm.

⑤Hay un anillo de timina.

ARN ribosomal (ARN ribosómico)

El ARN (ARN ribosomal (rRNA)) es el componente principal de los ribosomas, que son las fábricas que sintetizan las proteínas. de ARNr representa del 75% al ​​85% del ARN total en la célula, mientras que la cantidad de ARNt representa el 15% y la cantidad de ARNm solo representa del 3% al 5%. El ARNr se combina con las proteínas ribosómicas para formar ribosomas. Si se elimina el ARNr del ribosoma, la estructura de los ribosomas se colapsa. Los ribosomas procarióticos contienen tres tipos de ARNr: 5S, 16S y 23S. La velocidad es proporcional al tamaño y diámetro de la partícula. 5S contiene 120 nucleótidos, 16S contiene 1540 nucleótidos y 23S contiene 2900 nucleótidos. Hay cuatro tipos de ARNr en eucariotas y sus tamaños moleculares son 5,8S. 18S y 28S tienen aproximadamente 120, 160, 1900 y 4700 nucleótidos respectivamente.

El ARNr es monocatenario y contiene diferentes cantidades de A y U, G y C, pero tiene una extensa región bicatenaria. En la región de doble cadena, las bases están conectadas por enlaces de hidrógeno y forman una hélice en forma de horquilla.

La función del ARNr en la síntesis de proteínas no se comprende completamente. Existe una secuencia de nucleótidos que es complementaria al líder. secuencia de ARNm, que puede facilitar la unión del ARNm a los ribosomas.

ARNsn

Además de los tres ARN principales mencionados anteriormente, también existe ARN (ARN nuclear pequeño (ARNsn). ) en las células, es el componente principal del empalme del ARN en el procesamiento postranscripcional en eucariotas. Hasta ahora se han descubierto cinco tipos de ARNsn, con una longitud de aproximadamente 100 a 215 nucleótidos, que en los mamíferos siempre ha estado presente en el núcleo. , formando un ARN espliceosoma con alrededor de 40 proteínas nucleares, y juega un papel importante en el procesamiento postranscripcional del ARN. Además, existe la telomerasa ARN, que participa en la replicación de los extremos de los cromosomas.

Las moléculas de ARN anteriores son todas productos de la transcripción y el ARNm eventualmente se traduce en proteína. Sin embargo, el ARNr, el ARNt y el ARNsn no transportan información traducida a proteína y sus productos finales son todos ARN.

Interpretación del mecanismo de interferencia del ARN del Premio Nobel de Medicina 2006

En 1990, algunos científicos insertaron un gen que produce pigmento rojo en flores de petunia, con la esperanza de que las flores se transformaran en pigmentos rojos. Pero algo. Sucedió lo inesperado: la petunia se desvaneció por completo y sus pétalos se volvieron blancos.

Hasta que los científicos estadounidenses Andrew Farr y Craig descubrieron el mecanismo de interferencia del ARN, y misterios similares fueron explicados científicamente. Fue gracias a este descubrimiento en 1998. que dos científicos ganaron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de este año.

Según los hallazgos de Farr y Mello, el extraño fenómeno observado por los científicos en el experimento con la petunia se debió en realidad al "silencio" de un determinado gen en el organismo. El mecanismo que provoca el "silenciamiento" de los genes es el mecanismo de interferencia del ARN.

Anteriormente, las moléculas de ARN eran vistas sólo como el "intermediario" del ADN a la proteína y el "mensajero" que transmitía información genética del "modelo" al "trabajador". Sin embargo, la investigación de Farr y Mello hizo que la gente se diera cuenta de que no se debe subestimar el ARN. Puede activar o desactivar genes específicos, haciéndolos más o menos activos, afectando el tamaño y el desarrollo del organismo.

El jurado del Premio Nobel comentó los resultados de la investigación de Farr y Mello: "Sus hallazgos pueden explicar muchas observaciones experimentales confusas y contradictorias y revelar los mecanismos naturales que controlan el flujo de información genética. . Esto abre un camino nuevo campo de investigación."

Los científicos creen que la tecnología de interferencia de ARN no es sólo una poderosa herramienta para estudiar la función genética, sino que en un futuro próximo, esta tecnología puede usarse para "silenciar" directamente desde la fuente. "Los genes que causan enfermedades pueden usarse para tratar el cáncer e incluso el SIDA, lo que también tendrá un gran potencial en la agricultura. Desde esta perspectiva, el "silencio" es verdaderamente dorado. Investigadores de la Facultad de Medicina de Harvard, en Estados Unidos, utilizaron experimentos con animales para demostrar que la hepatitis en ratones experimentales se puede curar mediante tecnología de interferencia de ARN.

En la actualidad, aunque todavía existen algunos problemas que obstaculizan el desarrollo de la tecnología de interferencia de ARN, la comunidad científica en general tiene grandes esperanzas en esta tecnología emergente de bioingeniería. Ésta es una de las razones por las que el jurado del Premio Nobel no insistió en la "convención" de que los resultados de la investigación deben verificarse mediante décadas de práctica, sino que otorgó el premio a Fall y Mello.

Goran Hanson, presidente del Premio Nobel de Fisiología o Medicina, dijo: "Otorgamos el premio por el descubrimiento de un mecanismo básico. Científicos de todo el mundo han demostrado que este mecanismo es correcto. Es hora de otorgarle un Premio Nobel”.

Suplemento

El ácido ribonucleico (abreviado como ARN) es el portador de información genética en las células biológicas y en algunos virus y viroides.

El ARN es una molécula en cadena formada por la condensación de ribonucleótidos y enlaces fosfato. Las moléculas de ribonucleótidos están compuestas de fosfato, ribosa y bases. El ARN tiene cuatro bases principales: A adenina, G guanina, C citosina y U uracilo. Entre ellos, el U (uracilo) reemplaza a la T timina en el ADN y se convierte en la base característica del ARN.

A diferencia del ADN, el ARN es generalmente una molécula monocatenaria y no forma una estructura de doble hélice. Sin embargo, muchos ARN también necesitan formar una determinada estructura secundaria o incluso terciaria mediante el principio de emparejamiento de bases. para poder funcionar. Las reglas de emparejamiento de bases del ARN son básicamente las mismas que las del ADN, pero además del emparejamiento A-U y G-C, G-U también puede emparejarse.

En las células, el ARN se divide principalmente en tres categorías basadas en diferentes estructuras y funciones, a saber, ARNt (ARN de transferencia), ARNr (ARN ribosómico) y ARNm (ARN mensajero). El ARNm es una plantilla para la síntesis de proteínas y su contenido se transcribe del ADN en el núcleo celular. El ARNt es el reconocedor de la secuencia de bases (es decir, el código genético) del ARNm y también es el transportador de aminoácidos. El ARNr es un componente de los ribosomas, el lugar de trabajo de la síntesis de proteínas.

En cuanto a los virus, muchos virus sólo utilizan el ARN como único portador de información genética (a diferencia de los organismos celulares que generalmente utilizan ADN bicatenario como portador).

Las investigaciones desde 1982 han demostrado que muchos ARN, como los intrones tipo I y tipo II, RNasa P, HDV, ARN ribosómico de subunidad grande, etc., tienen la actividad de catalizar reacciones bioquímicas, es decir, Tienen actividad enzimática, estos ARN se llaman ribozimas.

Desde los años 90 se han descubierto fenómenos como el RNAi (ARN de interferencia), demostrando el importante papel del ARN en la regulación de la expresión génica.

En los virus de ARN, el ARN es el material genético, y los virus de plantas siempre contienen ARN. En los últimos años, se han descubierto en las plantas algunos agentes causantes de enfermedades infecciosas que son mucho más pequeños que los virus, llamados viroides. Los viroides son moléculas de ARN monocatenario de circuito cerrado sin proteínas. Además, existen dos tipos de ARN en las células eucariotas, a saber, el ARN nuclear heterólogo (hnRNA) y el ARN nuclear pequeño (snRNA). El HnRNA es el precursor del mRNA; el SnRNA participa en el empalme del hnRNA (un proceso de procesamiento).

Desde que se determinó la secuencia de bases del ARNt de alanina de levadura en 1965, los métodos para la secuenciación del ARN se han mejorado continuamente. En la actualidad, además de varios ARN más pequeños, como ARNt, 5SrRNA y 5.8SrRNA, se ha completado la determinación de la estructura primaria de algunos ARN virales, ARNm y ARN más grandes. Por ejemplo, el ARN del bacteriófago MS2 contiene 3569 nucleótidos.

Ácido ribonucleico

Ácido ribonucleico

Este producto puede promover la síntesis de proteínas en las células del hígado, mejorar el metabolismo de los aminoácidos, reducir la alanina aminotransferasa sérica y mejorar la proteína sérica en pacientes con hepatitis. La electroforesis regula la función inmune humana y promueve que las células hepáticas patológicas vuelvan a la normalidad. Se utiliza clínicamente para tratar la hepatitis y la cirrosis agudas y crónicas. Inyección intramuscular, 6 mg/vez, diluida con solución salina fisiológica, 65438 ± 0 veces, una vez en días alternos, 3 meses como ciclo de tratamiento.

Editar esta sección de ARN de interferencia (ARNi)

Definición de ARNi

Actualmente existen muchas definiciones de ARNi (ARN de interferencia), y diferentes datos lo definen El enfoque también es diferente. Si el ARNi se considera un fenómeno biológico, se puede definir como: ① El ARNi es un fenómeno de silenciamiento genético específico mediado por ARNbc, que bloquea la expresión génica a nivel transcripcional, postranscripcional y traduccional. ② RNAi es un fenómeno de silenciamiento transgénico guiado por dsRNA y dirigido a mRNA exógeno y endógeno para su degradación. El mecanismo de autodefensa con especificidad de secuencia de nucleótidos es el fenómeno del silenciamiento isógeno de genes homólogos al transgén o la invasión de ARN viral en las células después de la introducción de genes extraños o la invasión de virus.

Si se considera una biotecnología, se define como: ① ARNi se refiere al fenómeno de que el ARN bicatenario formado por ARN antisentido y ARN de cadena positiva inhibe específicamente los genes diana. Introduce artificialmente ARN bicatenario (ARN sentido y ARN antisentido) con la misma secuencia que el gen objetivo endógeno, induciendo así la degradación del ARNm del gen objetivo endógeno y logrando el propósito de prevenir la expresión génica. (2) ARNi se refiere al ARN bicatenario (dsRNA) sintetizado in vitro o in vivo que degrada específicamente su ARNm homólogo en pequeños fragmentos de 265,438+0 nt ~ 23 nt, silenciando el gen correspondiente. ③ El ARNi es un tipo de silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) que introduce ARN bicatenario (ARNds) homólogo y complementario al ARNm del gen diana en las células y degrada específicamente el ARNm, lo que provoca la pérdida del ARNm correspondiente. fenotipo funcional.

Aunque diferentes definiciones tienen diferentes dichos, los hechos descritos son básicamente los mismos. En pocas palabras, RNAi se refiere al fenómeno del silenciamiento de genes mediado por ARN.

Recientemente, la investigación en el campo antisentido ha aumentado debido al descubrimiento del ARN de interferencia (ARNi). Este fenómeno natural, descubierto por primera vez en Caenorhabditis elegans (1), es un poderoso mecanismo para el silenciamiento de secuencias específicas de genes transcritos. Debido a los avances realizados en el campo de RNAi durante los últimos dos años, se han publicado muchas revisiones en este campo (2-4). La interferencia del ARN es causada por largas moléculas de ARN de doble cadena, que pueden ser procesadas por la enzima Dicer en ARN con una longitud de 21 a 23 nucleótidos (ver figura). Se cree que la proteína RNasaIII funciona como un dímero, escindiendo ambas hebras de ARN bicatenario, y los extremos 3' de los productos digeridos se superponen entre sí. Esta pequeña molécula de ARN de interferencia (ARNip) luego se mezcla con el complejo silenciador inducido por ARN (RISC), que guía a las nucleasas para degradar el ARN objetivo.

Este mecanismo bioquímico conservado se puede utilizar para estudiar la función genética en muchos organismos modelo, pero su aplicación en células de mamíferos se ha visto obstaculizada porque largas moléculas de ARN bicatenario pueden inducir respuestas de interferón. Por lo tanto, Tuschi y sus colegas demostraron que el ARNip con una longitud de 21 nt puede inhibir específicamente la expresión génica en células de mamíferos, lo que supuso un avance revolucionario (5). Este descubrimiento estimuló una gran cantidad de estudios que utilizan la tecnología RNAi en células de mamíferos debido a su rendimiento significativamente mayor en comparación con la tecnología antisentido tradicional.

Curiosamente, además del ARN bicatenario corto (ARN corto en forma de horquilla (shRNA)), como el tallo-loop, también se puede convertir en ARNip después del procesamiento intracelular, produciendo así interferencia de ARN ( 6,7 ). Esto hace posible construir vectores que expresen ARN de interferencia, permitiendo el silenciamiento a largo plazo de la expresión génica en células de mamíferos (4,8).

El shRNA puede transcribirse mediante el promotor de la ARN polimerasa III. Normalmente, este promotor controla la transcripción de componentes del ARN nuclear pequeño (ARNsn) U6 (6, 7, 9, 10) o del ARN sep h 1 (11). Otro enfoque consiste en utilizar por separado el promotor U6 (6, 12, 13) para transcribir dos moléculas de ARN cortas. La expresión de ARNip mediada por vectores permite el análisis de fenotipos de pérdida de función a lo largo del tiempo. En células transfectadas de forma estable, todavía se puede observar silenciamiento después de dos meses (11).

Otra forma de prolongar el tiempo que el ARNip inhibe la expresión génica es modificar el ARN sintetizado químicamente con nucleótidos. Aunque la estabilidad del ARN bicatenario corto no modificado es inesperadamente alta en cultivo celular o in vivo, en algunos casos es necesario mejorar aún más la estabilidad del ARNip. Por tanto, se pueden introducir nucleósidos modificados (14) en los extremos de ambas hebras. Un ARNip con dos ARN 2'-O-metilo en el extremo 5' y cuatro nucleósidos metilados en el extremo 3' tenía la misma actividad específica que un ARNip no modificado con la misma secuencia, pero en cultivo celular la duración del silenciamiento génico se prolonga. . Sin embargo, aumentar los nucleósidos metilados en los ARNip o introducir grandes grupos alilo en los nucleósidos conducirá a una disminución de la actividad del ARNip.

La primera investigación sobre la interferencia del ARN en mamíferos consistió en inyectar un plásmido que codificaba shRNA en la vena de la cola de ratones (15, 16) mediante la inyección rápida de una gran cantidad de solución fisiológica. La expresión de genes indicadores (codificados en * * * plásmidos de transfección o ratones transgénicos) puede suprimirse eficazmente en la mayoría de los órganos. Además, se realizaron experimentos de interferencia de ARN utilizando el gen Fas como objetivo endógeno relacionado con el tratamiento de lesiones hepáticas (17). Después de la inyección de ARNip, los niveles de proteína y ARNm de Fas en células de hígado de ratón disminuyeron durante 10 días. El silenciamiento del gen Fas protegió a los ratones de la hepatitis fulminante causada por la inyección de un anticuerpo específico de Fas competidor. El 82% de los ratones tratados con ARNip sobrevivieron al período de observación de 10 días, mientras que todos los ratones de control murieron en 3 días.

La tecnología de introducción de alta presión utilizada en los estudios anteriores es un método tosco y no es adecuado para el tratamiento. Por lo tanto, los métodos utilizados en la terapia génica estándar se utilizan para la interferencia de ARN. Se utilizaron vectores retrovirales para introducir ARNip para suprimir el alelo del oncogén K-ras en células tumorales de páncreas humanas (18). La regulación negativa de la expresión del gen K-ras en células cancerosas hace que ya no sean capaces de formar tumores después de la inyección subcutánea en ratones desnudos atímicos. Este estudio también muestra la alta especificidad del ARNip, ya que solo se silencia el oncogén K-ras, mientras que el alelo de tipo salvaje que difiere solo en 1 par de bases no se silencia. Además, después de la inyección de adenovirus que expresan ARNip en el área del cuerpo estriado, se puede inhibir la expresión del gen GFP en el cerebro de ratones transgénicos (19). La inyección en la vena de la cola de adenovirus recombinante en ratones inhibe la actividad de la βb-glucosidasa. Curiosamente, en este experimento se utilizó un elemento de expresión de ARN polimerasa II con un promotor CMV y una cola poliA mínima, lo que abre la puerta al diseño de vectores de ARNip inducibles o específicos de tejido.

En resumen, se han realizado los primeros experimentos in vivo con ARNip y se espera que pronto se utilicen otros genes importantes como objetivos de investigación. Hasta el momento, no se han observado efectos tóxicos causados ​​por la aplicación de ARNip, pero antes de comenzar los ensayos clínicos para tratar enfermedades humanas, se debe tener cuidado de eliminar los efectos secundarios graves causados ​​por el uso prolongado de ARN de interferencia. Debido a que silenciar la expresión genética con ARNip es similar a la tecnología antisentido tradicional, los investigadores se beneficiarán de las lecciones aprendidas durante más de una década de investigación en tecnología antisentido, como la necesidad de utilizar controles apropiados para demostrar que las supresiones de la expresión genética son específicas y analizar las respuestas inmunes. en detalle los efectos no deseados que puedan surgir en el sistema.

Resumen

Después de un largo período de altibajos, la tecnología antisentido ha recibido cada vez más atención en los últimos años. Los nucleósidos modificados pueden mejorar la afinidad y la estabilidad biológica de la superficie objetivo y reducir la toxicidad. La investigación en esta área ha logrado avances importantes. Dado que la mayoría de los nuevos análogos de ADN no pueden activar la RNasaH, el diseño de oligonucleótidos antisentido debe considerar si es necesario retener el ARNm objetivo, por ejemplo, si se debe cambiar el patrón de empalme o degradar el ARNm objetivo (en este caso se debe utilizar la tecnología Gapmer). . Se pueden obtener ribozimas estables con alta actividad catalítica modificando sistemáticamente ribozimas naturales o mediante técnicas de selección in vitro. Algunos oligonucleótidos y ribozimas antisentido han entrado en ensayos clínicos y en 1998 se aprobó un fármaco antisentido.

Un avance importante fue el descubrimiento de que se podían utilizar moléculas cortas de ARN bicatenario para silenciar específicamente la expresión genética en células de mamíferos. Este enfoque es significativamente más eficiente que la tecnología antisentido tradicional y se han publicado algunos datos experimentales in vivo. Por lo tanto, se espera que la tecnología antisentido se utilice ampliamente en la investigación de genes funcionales desconocidos, la identificación y el tratamiento de objetivos farmacológicos.

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