Secuenciación de biblioteca de receptores de células T

El receptor de células T es una molécula proteica que las células T utilizan para reconocer antígenos específicos en la superficie de las células diana. Está formado por una cadena alfa y una cadena beta (codificadas por TRA y TRB respectivamente) o una cadena gamma y delta. La cadena (codificada respectivamente por TRG y TRB) es principalmente un heterodímero compuesto por una cadena α y una cadena β. La cadena α y la cadena β están compuestas por una región constante (región C), una región variable (región V), una región transmembrana y una región citoplasmática. La región V reconoce específicamente péptidos antigénicos/complejos de antígenos de histocompatibilidad (MHC). . Las regiones V tanto de la cadena α como de la cadena β contienen tres regiones hipervariables, también conocidas como regiones determinantes de complementariedad (CDR), a saber, CDR1, CDR2 y CDR3. La cadena β también tiene CDR4, y CDR3 es la principal CDR responsable de reconocer. antígeno procesado.

El TCR es extremadamente diverso, con hasta 10^15 - 10^18 especies, por lo que es posible que el cuerpo reconozca cualquier antígeno. ¿Cuál es entonces la causa de la diversidad de TCR?

La diversidad de TCR es causada principalmente por la recombinación de V (D) J, que es un proceso aleatorio, y los propios genes V, D y J son diversos. Diferentes clones de células T se someten a un reordenamiento genético y se producen conexiones. de diferentes segmentos de genes produce genes específicos (VDJ) y genes (VJ), expresando así TCR específicos. Este es el principal mecanismo para la generación de diversidad de TCR.

La cadena TCRα se produce por recombinación VJ, mientras que la cadena β se produce por recombinación VDJ; de manera similar, la producción de la cadena TCRγ implica recombinación VJ, mientras que la cadena TCRδ se produce por recombinación VDJ.

En ausencia de estimulación antigénica en individuos normales, el reordenamiento del gen TCR es aleatorio y las células T son multifamiliares y policlonales. Después de ser estimulado por diferentes antígenos, el gen de la región TCR V puede reconocer específicamente el antígeno y permitir que las células T que portan dichos genes se expandan ventajosamente.

Método de secuenciación TCR:

1. Utilizando ADN como material de partida, utilizando el método de PCR multiplex para amplificar el fragmento CDR3 de TCRβ:

2. Comenzando con ARN Material de partida, utilizando el método 5'RACE para amplificar la secuencia TCR de longitud completa:

Software de análisis: mixcr

Este es un software de análisis de secuenciación TCR muy fácil de usar. adecuados para una variedad de métodos experimentales, incluidos datos de PCR multiplex, 5'RACE y RNAseq y WES, también son muy simples de usar.

Para el método de PCR multiplex, los comandos de análisis del software son los siguientes:

Para el método 5'RACE, los comandos de análisis del software son los siguientes:

La secuenciación de TCR se utiliza principalmente en:

(1) Frecuencia de uso de los segmentos de genes V, D y J, longitud de CDR3, proporción de bases insertadas y eliminadas, patrón de uso de aminoácidos de CDR3, abundancia de antígenos diferentes secuencias de receptores y diversidad y clonalidad de la biblioteca;

(2) Detectar y comprender las características de la proliferación clonal o de las células T específicas de antígeno;

(3) Realizar un seguimiento de los cambios en las enfermedades. clones de células T relacionadas en diferentes momentos;

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(4) Estudiar los clones de células inmunes entre diferentes individuos a través de secuencias de aminoácidos de TCR.

Conceptos relacionados:

Secuencia TCRβ efectiva:

Secuencia de nucleótidos CDR3 y secuencia de aminoácidos CDR3:

Misma cadena TCRβ Secuencia CDR3 denominada un clonotipo: número de secuencia y frecuencia de cada clonotipo:

Diversidad: combinación VJ, combinación VDJ, número de clonotipos de nucleótidos CDR3, número de clonotipos de aminoácidos CDR3:

Índice de comparación de diversidad TCR : Entropía de Shannon, cuanto más cerca esté el valor de 0, peor será la diversidad inmune, y cuanto más cerca esté el valor de 1, mejor será la diversidad inmune.

Clon altamente pendiente (HEC) se refiere a secuencias de CDR3 cuya expresión supera el 0,5% del total de secuencias de CDR3.

Ajuste normal de las longitudes de los aminoácidos CDR3: en los cuerpos normales, las longitudes de los aminoácidos CDR3 se distribuyen normalmente. Sin embargo, en pacientes con enfermedades, algunas secuencias específicas de aminoácidos CDR3 se expresarán en grandes cantidades. Hay una diferencia significativa en la longitud de los aminoácidos de CDR3.

Distribución de frecuencia de uso de genes: