principio experimental de wb
El principio del experimento WB es el siguiente:
El experimento WB consiste en separar la muestra de proteína mixta mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y luego utilizar un sifón especial o un aparato eléctrico. dispositivo de campo para transferirlo a un medio de fase sólida (como una membrana de PVDF) y luego usar la proteína o el péptido en el portador sólido como antígeno.
Se une específicamente al primer anticuerpo correspondiente y luego se combina con la enzima o el segundo anticuerpo marcado con isótopos y finalmente detecta la expresión del gen objetivo específico mediante el desarrollo del color del sustrato o la autorradiografía de los ingredientes proteicos.
Preparación de muestras de proteínas
La muestra original puede ser células, tejidos, sobrenadantes de cultivos, proteínas inmunoprecipitadas o purificadas por afinidad. El siguiente es el método de procesamiento de muestras celulares para la detección cualitativa de proteínas diana. , consulte la literatura relevante para conocer el resto de los métodos de preparación de muestras.
1.Cultivo de células o tratamiento farmacológico.
2. Deseche el medio de cultivo y enjuague las células dos veces con 1XPBS para eliminar todo el medio de cultivo residual.
3. Agregue el tampón de muestra 1XSDS, raspe las células y transfiéralas al tubo Ep. Nota: opere sobre hielo.
4. Ultrasone durante 10 a 15 segundos para cortar el ADN y reducir la viscosidad de la muestra.
5. Hervir la muestra durante 5 minutos.
6. Centrifugar a 12000g durante 5 minutos y recoger el sobrenadante.
Electroforesis SDS-PAGE
1. Limpieza de la placa de vidrio
2. Llenado y carga de gel
1. están alineados. Colóquelo en el clip y apriételo. Luego pégalo verticalmente en el estante y prepárate para rellenar con pegamento.
2. Preparar gel separador al 10%, añadir TEMED y agitar inmediatamente antes de rellenar. Al llenar con pegamento, use una pistola de 10 ml para absorber 5 ml de pegamento y suéltelo a lo largo del vidrio hasta que la superficie del pegamento se eleve a la altura de la línea media del cinturón verde. Luego agregue una capa de agua al pegamento y el gel sellado con líquido se gelificará más rápido.
3. Cuando hay una línea de refracción entre el agua y el pegamento, significa que el pegamento se ha gelificado. Espere otros 3 minutos para que el pegamento se solidifique por completo, luego vierta el agua sobre el pegamento y absorba el agua con papel absorbente.
4. Preparar gel concentrado al 4%, añadir TEMED y agitar inmediatamente antes de rellenar. Llene el espacio restante con gel apilable e inserte el peine en el gel apilable. Después de que el gel concentrado se solidifique, sostenga ambos lados del peine con ambas manos y sáquelo verticalmente.
5. Enjuague el gel de apilamiento con agua y colóquelo en el tanque de electroforesis.
6. Agregue 1×Tris-Glicina o tampón de electroforesis SDS a los tanques superior e inferior del tanque de electroforesis y cargue la muestra.
7. Conecte el tanque de electroforesis al instrumento de electroforesis. El tanque superior está conectado al electrodo negativo y el tanque inferior está conectado al electrodo positivo. El voltaje inicial de encendido es de 70-80 V y 100 V después de 10 minutos o cuando se realiza la electroforesis con azul de bromofenol. migra a 1 cm del fondo, detenga la electroforesis.
Membrana de transferencia
1. Remojar el gel en el tampón de transferencia y equilibrarlo durante 10 minutos. Nota: Si se detectan proteínas de moléculas pequeñas, este paso se puede omitir porque las proteínas de moléculas pequeñas se difunden fácilmente fuera del gel.
2. Recorta 6 trozos de membrana y papel de filtro según el tamaño del gel y colócalos en el tampón de transferencia para que se equilibren durante 10 minutos. Si se utiliza una membrana de PVDF, es necesario remojarla y saturarla con metanol puro durante 3 a 5 segundos.
3. Armar el sándwich de transferencia: esponja con 3 capas de film de papel de filtro y 3 capas de esponja de papel de filtro. Luego de colocar cada capa, utilizar un tubo de ensayo para eliminar las burbujas de aire. Recuerda: pon el pegamento en el lado negativo (lado negro).
4. Coloque el tanque de transferencia en un baño de hielo, colóquelo en el sándwich (el lado negro hacia el lado negro), agregue el tampón de transferencia, conecte el electrodo, 100 V, 1 h (la corriente es de aproximadamente 0,3 A).
5. Una vez completada la transferencia, corte la energía y retire la membrana de hibridación.