El nombre completo y los campos de aplicación de PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una tecnología de amplificación de ácidos nucleicos in vitro desarrollada a mediados de los años 1980. Tiene las destacadas ventajas de ser específico, sensible, de alto rendimiento, rápido, simple, reproducible y fácil de automatizar. Puede amplificar un gen objetivo o un fragmento de ADN hasta 100.000 veces o incluso un millón de veces en un tubo de ensayo en unas pocas horas, y puede observarse y juzgarse directamente a simple vista; puede amplificar suficiente ADN a partir de un cabello, una gota; de sangre o incluso de una célula, para su análisis, investigación, detección e identificación. Lo que antes llevaba días y semanas se puede hacer en horas con PCR. La tecnología PCR es una iniciativa revolucionaria y un hito en el campo de la biomedicina.

Una breve historia de la tecnología PCR

Han pasado más de 65.438.000 años desde que se concibió por primera vez la PCR para el estudio de ácidos nucleicos. A finales de los años 1960 y principios de los años 1970, la gente se dedicó a la investigación del aislamiento de genes in vitro. En 65,438 0,976,5438 0, Korana propuso por primera vez la idea de la amplificación de ácido nucleico in vitro: "Después de la desnaturalización del ADN, la hibridación con cebadores apropiados, la extensión de los cebadores con ADN polimerasa y la repetición de este proceso, se puede clonar el ARNt".

Realización de la PCR En 1985, Mullis, del Laboratorio de Genética Humana de la empresa PE-Setus en Estados Unidos, inventó la reacción en cadena de la polimerasa que hizo época. Su principio es similar al de la replicación del ADN in vivo, pero proporciona condiciones adecuadas para la síntesis de ADN in vitro en tubos de ensayo: ADN molde, cebadores oligonucleotídicos, ADN polimerasa, sistema tampón apropiado, desnaturalización del ADN, renaturalización y temperatura y tiempo prolongados.

Mejora y perfección de la PCR La ADN polimerasa original utilizada por Mullis es el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli. Tiene las siguientes desventajas: ① La enzima Klenow no es resistente a altas temperaturas y se desnaturalizará e inactivado a 90°C. Cada ciclo requiere Agregar nuevamente. ② La reacción de extensión del cebador se realiza a 37 °C, lo que es propenso a que las bases no coincidan entre la plantilla y el cebador. La especificidad del producto de la PCR es pobre y los fragmentos de ADN sintetizados son desiguales. Aunque esta tecnología de PCR catalizada por enzima Klenow tiene muchas ventajas sobresalientes en comparación con la amplificación genética tradicional, la enzima Klenow no es resistente al calor y se inactivará cuando la plantilla de ADN se desnaturalice térmicamente, y cada adición de enzima solo puede completar un paso. El ciclo de reacción de amplificación añade muchas dificultades a los procedimientos operativos de la tecnología de PCR. Esto ha impedido que la tecnología de PCR atraiga suficiente atención en el campo biomédico durante algún tiempo. A principios de 1988, Keohanog utilizó ADN polimerasa T4 para realizar la PCR. Los fragmentos de ADN amplificados eran muy uniformes y muy auténticos, y solo se esperaba un fragmento de ADN. Sin embargo, en cada ciclo aún es necesario agregar nuevas enzimas. En 1988, Zhaisi et al. extrajeron una ADN polimerasa termoestable de una bacteria termófila acuática aislada de aguas termales. La enzima tiene las siguientes características: ① Resistencia a altas temperaturas, la actividad residual es superior a 90 después de 2 horas a 70 °C, la actividad residual es superior a 60 después de 2 horas a 93 °C y la actividad residual es superior a 40 después de 2 horas a 95°C. ② No se pasivará durante la desnaturalización térmica y no es necesario agregar nuevas enzimas después de cada reacción de amplificación. ③La especificidad y la eficiencia de amplificación de los fragmentos amplificados mejoran enormemente y la longitud de amplificación aumenta (2,0 Kb). Debido a que se mejoran la especificidad y eficiencia de la amplificación, su sensibilidad también mejora considerablemente. Para distinguirla del fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli, la enzima se denominó Taq ADN polimerasa. El descubrimiento de esta enzima condujo al uso generalizado de la PCR.

Principios básicos de la tecnología PCR

Los principios básicos de la tecnología PCR son similares al proceso de replicación natural del ADN, y su especificidad depende de cebadores oligonucleotídicos que son complementarios a ambos extremos del secuencia objetivo.

La PCR consta de tres pasos de reacción básicos: desnaturalización-hibridación-extensión: ① Desnaturalización del ADN molde: después de calentar el ADN molde a aproximadamente 93 °C durante un cierto período de tiempo, el ADN bicatenario del ADN molde o el doble -El ADN amplificado por PCR se disocia en ADN monocatenario, de modo que pueda combinarse con el cebador para prepararse para la siguiente ronda de reacción (2) Recocido (renaturalización) del ADN molde y el cebador: después del molde; El ADN se calienta y se desnaturaliza en una sola hebra, la temperatura se enfría a aproximadamente 55 °C y el cebador y el ADN molde son un emparejamiento de secuencia complementaria de la hebra. ③ Extensión del cebador: bajo la acción de la TaqDNA polimerasa, la El conjugado plantilla-cebador de ADN utiliza dNTP como materia prima de reacción y la secuencia objetivo como plantilla. Basado en los principios de emparejamiento de bases y replicación semiconservativa, se sintetiza un conjugado plantilla-cebador de ADN con una nueva cadena de replicación semiconservativa. complementaria a la cadena de ADN plantilla, y repitiendo los tres procesos de desnaturalización-hibridación-extensión, se pueden obtener más "cadenas de replicación semiconservadoras". Esta nueva cadena se puede utilizar como plantilla para el siguiente ciclo. Se necesitan de 2 a 4 minutos para completar un ciclo y el gen objetivo que se va a amplificar se puede amplificar un millón de veces en 2 a 3 horas. El número de ciclos necesarios para alcanzar una meseta depende del número de copias de la plantilla en la muestra.

Aplicación de la PCR en el diagnóstico genético y detección de marcadores tumorales.