Cambios en los perfiles de expresión genética antes y después de la transfección del gen nm23-H1 en células de cáncer de pulmón L9981
Palabras clave: l 9981; chip genético; expresión génica; gen Nm23-H1
Número de clasificación de la Biblioteca de China: R734.2
Documento código de identificación: a
Número de artículo: 1007-7847(2006)01-0077-05.
Se ha demostrado que el gen nm23-H1 es un gen supresor de metástasis tumorales. La transformación del ADNc del gen nm23-H1 en la línea celular L9981 de cáncer de pulmón de células grandes altamente metastásica humana que carece de expresión del gen nm23-H1 puede revertir su fenotipo maligno. Sin embargo, no se comprende completamente el mecanismo molecular por el cual nm23-H1 inhibe la invasión y metástasis del cáncer de pulmón. Nuestros estudios anteriores han demostrado que el efecto inhibidor del gen nm23-H1 sobre la invasión tumoral y la metástasis se puede lograr regulando genes relacionados con la metástasis. Para estudiar más a fondo el mecanismo molecular de nm23-H1, utilizamos un chip genético para detectar la transfección de nm23-H1 a L99865438.
1 Materiales y métodos
1.1 Materiales
l, 1.1 Líneas celulares
1) L9981 (célula de cáncer de pulmón de células grandes altamente metastásica línea 2) L9981-nm23-H1 (línea celular L9981 que expresa establemente el gen nm23-H1). Todos fueron proporcionados por el Laboratorio Clave de Cáncer Molecular de Pulmón, Hospital del Oeste de China, Sichuan.
1.1.2 Reactivos y equipos de uso común
El suero de ternera refinado y el medio de cultivo RPMI t640 se adquirieron de Hy-clone Company. Prepare una solución madre de 1 mmol/L con una solución de NaOH de 1,20 mmol/L y guárdela a 4°C. Superscript TM II ribonucleasa H-transcriptasa inversa (catalizada por 1 nitrógeno. No. 18064-014), dATP, dGTP, dCTP, cebador dTYPOligod (T) (Bioasia Synthesis), Cy5 (Amersham, Cat, No. PA55021), Cy3 ( Amersham, n.º de cat. PA53021), inhibina de ARN (Takara, n.º de cat. D2311A), kit extraíble de nucleótidos rápidos Ola (OIAGEN, n.º de cat. 28306) Máquina genética: Impresión de chips OmniGrid 100Pixsys5500 únicamente desde el escáner de chips ScanArrayLite y su El software de análisis Quantarray se adquirió de GsiLumonics y la caja mixta de portaobjetos y chips se adquirió de Coming.
Chip genético 1.1.3
El número de versión del chip utilizado en el proyecto es el chip de perfil de expresión génica de ADNc humano 2.2, el número de catálogo del producto es SBC-R-HC-100-22. , y el número de chip son 17874 y 17873 (Shanghai Biochip Engineering Company).
Método 1.2
Purificación del ARN total de 1.2.1
(RNeasy Mini Kit) El ARN total se purificó con el kit QIAGEN RNeasy. Para conocer los principios y métodos operativos detallados, consulte el protocolo rn easy Mini 01.
Detección de calidad de 1, 2, 2 ARN total
(detección de Labonchip) Para conocer los pasos de operación específicos, consulte el manual de usuario del chip de perfil de expresión de cD-NA humano, SBC-H -HC-100- 22. Para obtener resultados detallados, consulte el informe de prueba de calidad de la muestra. El laboratorio en un chip preparó el gel de acuerdo con el manual de funcionamiento del analizador Agilent 2100 y realizó la electroforesis de ARN de acuerdo con las indicaciones del software para evaluar la calidad del ARN.
1.2.3 Preparación de la muestra
El CDNA se digirió con Sau3Al, luego se ligó con adaptadores y luego se amplificó con cebadores universales de PCR. El producto de la PCR se purificó usando un kit de purificación de productos de la PCR y se extrajeron 500 ng. El método de etiquetado experimental es el método de etiquetado directo de ADNc. El ARN del grupo experimental (L9981-nm23-H1) está marcado con fluorescencia de cy3 y el ARN del grupo de control (L9981) está marcado con fluorescencia de cy5. Agregue el cebador marcado con Cy3/Cy5 (100 LLM 01/L) 21LL (el grupo de control tratado con NaOH está marcado con Cy5 y el grupo de tratamiento tratado con As20 está marcado con Cy3), y luego realice la amplificación y purificación por PCR bajo el mismo condiciones La concentración final del producto de PCR se ajustó a 200 mg/L.
1, 2.4 Hibridación
Después de la desnaturalización a 95 °C, agregue la muestra etiquetada a la superficie del conjunto de chips prehibridado, cúbrala con un cubreobjetos y colóquela en una caja de hibridación. , e hibridar a 42°C durante 18 horas.
1.2.5 Detección y análisis
Los resultados del chip se escanearon con un escáner Agilent con una resolución de escaneo de 10 μm y los datos del PMT 100 se leyeron con el software Ima-gene. Finalmente, se utilizó Genespring para el análisis de normalización, y la relación final fue cy3/cy5, es decir, grupo experimental/grupo de control. Los criterios de selección para genes diferenciales son (1) Proporción >: O =2 es un gen regulado positivamente y la proporción = 0,5 es un gen regulado negativamente.
Análisis estadístico del 1.3
Método de análisis de conglomerados. El análisis de conglomerados se realizó utilizando genespring y software de análisis de conglomerados.
2 resultados
2.1 Perfil de electroforesis de ARN celular total
Después de la extracción y purificación del ARN total de dos líneas celulares (L9981, nm23-H1 y L9981), 1 La electroforesis en gel de agarosa muestra las bandas 28, 18 y 5S obvias, y la banda 28S es obviamente más brillante que la banda 18S
2.2 Resultados y análisis de la hibridación del chip genético
Luego, las imágenes escaneadas de Cy5 y Cy3 se superponen completamente en el mapa de hibridación resultante (Figura 2), los puntos rojos indican expresión baja, los puntos verdes indican expresión alta y los puntos amarillos indican que no hay cambios en el nivel de expresión. Después del análisis del software, se obtuvo un diagrama de dispersión de la hibridación del chip (Figura 3). El eje y de cada punto representa la intensidad relativa de la señal de hibridación Cy3 y el eje x representa la intensidad relativa de la señal de hibridación Cy5. La relación Cy5/Cy3 del punto en la línea recta de 45 grados (mostrada por la línea continua) es L, lo que significa que no hay diferencia. El punto alejado de la línea recta de 45 grados significa que la diferencia es mayor. El punto que cae fuera de las dos líneas de puntos significa que la relación Cy3/Cy5 es mayor que 2. o puntos menores que 0,5.
2.3 Resultados del cribado de chips genéticos
Antes y después de la transfección del gen nm23-H1 en células L9981, había un total de ***1792 genes, cuya expresión aumentó (hasta regulado) a 1156 y la expresión disminuyó (down) a 642. Entre los genes regulados positivamente, 1038 genes tenían funciones desconocidas. Entre ellos, hay 31 genes relacionados con el ciclo celular y la apoptosis, 0 oncogenes, 18 genes supresores de tumores, 12 genes relacionados con metástasis, 13 citoquinas y factores de transcripción, 38 genes relacionados con proteínas y señalización celular, y 9 proteínas de matriz extracelular y citoesquelética. , entre las cuales funciones hay 541.
Sin embargo, hay 101 genes conocidos, incluidos 12 genes relacionados con el ciclo celular y la apoptosis, 11 genes relacionados con oncogenes, 3 genes relacionados con genes supresores de tumores y 14 genes relacionados con la metástasis. Hay 21 genes relacionados con la señalización celular y la clara de huevo. .
3 Discusión
El gen nm23-H1 es un gen supresor de metástasis tumorales, y su baja expresión y deleción están estrechamente relacionadas con la invasión y metástasis del cáncer de pulmón. Nuestros estudios anteriores encontraron que la baja expresión, las mutaciones y las eliminaciones alélicas de la proteína del gen nm23-Hi y el mBNA están estrechamente relacionadas con una alta metástasis y un mal pronóstico del cáncer de pulmón. La pérdida de heterocigosidad del alelo nm23-HI existe en células de cáncer de pulmón de células grandes altamente metastásicas humanas L9981 con alto potencial metastásico. Las células L9981 tienen fuertes capacidades de invasión y clonación in vitro, y la capacidad de metastatizar espontáneamente en los pulmones en ratones desnudos es de 100. Estudios anteriores han demostrado que la introducción del gen nm23-HI en la línea celular L9981 puede revertir su fenotipo maligno, como lo demuestra una reducción significativa en la proliferación, la formación de colonias, la invasión y la metástasis pulmonar espontánea en ratones desnudos. Tsinghua Zhou et al. descubrieron que el cáncer de pulmón con deleción del gen nm23-H1 suele ir acompañado de una expresión anormal de ciertas moléculas relacionadas con la invasión tumoral. Se especula que el gen nm23-H1 puede ser un gen regulador anterior de genes relacionados con el ". Cascada de supresión de metástasis del cáncer de pulmón", que tiene un impacto en el potencial de metástasis del tumor. El efecto inhibidor se logra regulando genes posteriores. Sin embargo, el mecanismo molecular por el cual el gen nm23-HI revierte el fenotipo maligno del cáncer de pulmón aún no está claro.
La tecnología de chips genéticos nos proporciona el soporte técnico ideal para estudiar el mecanismo molecular de los cambios estructurales y funcionales de nm23-H1 que conducen a la invasión y metástasis del cáncer de pulmón. Los chips de perfiles de expresión genética tienen las características de alto rendimiento, gran escala, alta eficiencia y alta sensibilidad, y pueden analizar las diferencias en la abundancia de ARNm de dos o más grupos de diferentes fuentes. Al calcular la proporción de señales de hibridación y el análisis estadístico, podemos obtener información genética expresada diferencialmente.
Este experimento utilizó micromatrices de expresión de genes tumorales para analizar los cambios en la expresión de genes relacionados antes y después de la transfección del gen nm23-H1 en células L9981. La aplicación de microarrays de expresión genética proporciona evidencia genómica para estudiar el mecanismo molecular del gen nm23-H1, superando las limitaciones de estudios previos de aislamiento de un solo gen. En particular, la introducción de genes exógenos en células que no los expresan evita diferencias histológicas en el muestreo de muestras, lo que hace que los resultados experimentales sean más confiables y fáciles de analizar. En este estudio, se utilizó el chip de perfil de expresión génica de ADNc SBC-R-HC-100-22 que contiene 14.000 genes para transfectar el gen nm23-Hl en células L981. Al comparar la información diferencial de sus expresiones genéticas, buscamos genes relacionados con la expresión del gen nm23-H1. En este estudio, se descartaron **1792 genes expresados diferencialmente. Después de la transfección del gen nm23-Hl, había un total de 1156 genes, incluidos 1035 genes. Había 642 genes con expresión génica regulada negativamente, de los cuales 541 eran genes desconocidos y 101 tenían razones funcionales. Los genes que se sabe que están regulados hacia arriba y hacia abajo incluyen: genes del ciclo celular y de la apoptosis, oncogenes, genes supresores de tumores, genes relacionados con metástasis, factores de citocinesis y transcripción, genes relacionados con proteínas y señalización celular, matriz extracelular y proteínas citoesqueléticas. Entre los genes regulados positivamente, existen muchos genes relacionados con metástasis tumorales, como E-Cad, β-catenina, nm23 y TIMP-1,2, etc. , y los genes regulados negativamente relacionados con la metástasis tumoral incluyen principalmente Ras, VEGF, PDGF-A, ERK-/, 2, c-src, etc. Estos resultados son consistentes con nuestros hallazgos anteriores.
Sin embargo, este estudio también encontró que la alta expresión del gen nm23-H1 también puede aumentar la expresión de ciertos genes supresores de tumores, mejorar la actividad de las citoquinas y factores de transcripción, aumentar la actividad de las enzimas de la matriz extracelular y Afectan a las células. Síntesis de proteínas del esqueleto. Por lo tanto, se puede inferir que el gen nm23-H1 puede inhibir la invasión y metástasis de células tumorales al inhibir la proliferación celular y la tasa de formación de colonias, reducir la actividad de las metaloproteinasas de la matriz, inhibir la expresión de genes proangiogénicos, etc., por lo que Inhibir la progresión tumoral.
Se puede ver que el gen nm23-Hl invierte el fenotipo maligno de las células L9981 mediante la regulación de genes relacionados aguas abajo, y es un gen clave y un gen aguas arriba en la regulación positiva de la "cascada de supresión de metástasis del cáncer de pulmón".
En resumen, la invasión y metástasis tumoral son el resultado de la interacción de múltiples genes y factores. Uno o dos genes clave cooperan entre sí en el tiempo y el espacio para promover la canceración, invasión y metástasis de las células. Por lo tanto, al estudiar los mecanismos moleculares de la invasión y metástasis tumoral, también es necesario analizar múltiples genes, no solo unos pocos genes individuales. Los chips genéticos proporcionan una poderosa herramienta de investigación para estudiar la aparición y el desarrollo de tumores y las interacciones entre genes. Este artículo es el texto completo del artículo original. Los usuarios que no tengan un navegador de PDF primero deben descargar e instalar el texto completo del texto original.