¿Cuáles son los principios y aplicaciones de qPCR?

1. Principio

En la fase exponencial, la cantidad de producto de PCR aproximadamente se duplica en cada ciclo. Sin embargo, a medida que avanza la reacción, los componentes de la reacción se consumen y eventualmente uno o más componentes quedan limitados. En este punto, la reacción se ralentiza y entra en una meseta.

Inicialmente, la fluorescencia permanece en los niveles de fondo y, aunque el producto se acumula exponencialmente, no se detecta ningún aumento de fluorescencia. Con el tiempo, se acumula suficiente producto de amplificación para producir una señal fluorescente detectable.

El número de ciclos en los que esto ocurre se llama ciclo de cuantificación, o q. Dado que el valor q se mide durante la fase exponencial donde los reactivos no son limitantes, se puede utilizar qPCR en tiempo real para calcular de manera confiable y precisa la cantidad inicial de plantilla presente en la reacción basándose en una función exponencial conocida que describe la progresión de la reacción. .

La Cq de una reacción está determinada principalmente por la cantidad de plantilla presente al comienzo de la reacción de amplificación. Si hay una gran cantidad de plantilla al comienzo de la reacción, se requieren relativamente pocos ciclos de amplificación para acumular suficiente producto para producir una señal fluorescente por encima del fondo. Por tanto, la reacción tendrá un Cq bajo o temprano.

2. Aplicación

La detección cuantitativa por PCR/qPCR por fluorescencia en tiempo real se ha convertido en la herramienta preferida para la determinación y cuantificación rápida y sensible de ácidos nucleicos en diversas muestras biológicas, con una gran variedad. de aplicaciones, como análisis de expresión genética, detección de organismos genéticamente modificados en alimentos y fenotipado del cáncer.

En los laboratorios de investigación, los ensayos qPCR se utilizan ampliamente para medir cuantitativamente el número de copias de genes (dosis de genes) o genes mutados. en la existencia de líneas celulares transformadas. Combinado con la PCR con transcripción inversa (RT-PCR), el análisis qPCR se puede utilizar para cuantificar con precisión los cambios en la expresión genética, por ejemplo, midiendo los cambios en las células que aumentan o disminuyen los niveles de ARNm en respuesta a diferentes condiciones ambientales o tratamientos farmacológicos.

Instrumentos de qPCR/PCR en tiempo real

Los sistemas de detección de PCR en tiempo real consisten en un termociclador equipado con un módulo de detección óptica que mide cuándo un fluoróforo se une a la secuencia objetivo durante cada El ciclo de amplificación genera una señal fluorescente.

Los sistemas de detección de PCR en tiempo real de Bio-Rad cuentan con termocicladores y módulos intercambiables para la detección simple y múltiple de fluoróforos y unidades de PCR fijas en tiempo real. Todos los sistemas qPCR tienen capacidades de gradiente térmico.