¿Qué es un sistema de un componente y un sistema de un solo factor?

Todos los ingredientes se concentran en la unidad de producción. El sistema de producción de retrovirus clásico consta de células productoras de virus (VPC), y el retrovirus recombinante se secreta continuamente en el sobrenadante del cultivo a través de las células VPC. Este sistema de producción es el más sencillo de operar, pero la producción suele ser baja o inestable. Con esta estrategia, es necesario colocar de manera estable en las células productoras todos los componentes necesarios para la producción de virus recombinantes. Esta estrategia es difícil de implementar en la producción de muchos vectores virales porque muchos productos genéticos virales son destructivos para las células o no pueden expresarse de manera estable en las células.

Sección 1: Principios de la generación de vectores virales

La generación de vectores virales se basa en la comprensión del ciclo de vida del virus y la biología molecular. Para estudiar vectores virales, primero debemos comprender completamente la estructura y función del genoma viral, y lo mejor es obtener la información de secuencia completa del genoma viral. Los genomas virales se pueden dividir en regiones codificantes y no codificantes. Los genes de la región codificante producen proteínas estructurales y no estructurales del virus; se pueden dividir en genes esenciales y genes no esenciales según su impacto en la replicación infecciosa del virus. La región no codificante contiene elementos que actúan en cis necesarios para la replicación y el empaquetamiento viral.

Varias partículas de virus de tipo salvaje tienen ciertas capacidades de empaquetamiento, es decir, la longitud del genoma viral empaquetado es limitada. En términos generales, la capacidad de empaquetado del virus no supera el 105 ~ 110% del tamaño de su propio genoma.

El desarrollo de la tecnología de recombinación genética permite producir vectores virales. El método más sencillo consiste en insertar ADN exógeno de longitud adecuada en regiones no deseadas del genoma viral y empaquetarlo en partículas de virus recombinantes. Por ejemplo, en nuestro laboratorio, se insertó un casete de expresión del gen lacZ de 4,5 kb (CMV-lacZ-polyA) en el sitio XbaI del gen UL44 (glicoproteína C) del virus HSV1, y el resto del genoma viral permaneció sin cambios. Así se construyó el virus recombinante HSV1-lacZ100 (Wu Xiaobing et al., 100), porque el producto del gen UL44 no es necesario para la toxicidad del virus HSV. Utilizando este virus recombinante para infectar células, se puede utilizar el gen lacZ. introducido en las células y expresado eficientemente. De la misma manera, los fragmentos de los genes rep y cap (4,3 kb) del virus AAV-2 se insertaron en el gen UL2 (que codifica la uracilo ADN glicosilasa) o UL44 (que codifica la glicoproteína C) del virus HSV1 para construir un virus auxiliar. rHSV-rc contiene todas las funciones auxiliares necesarias para la replicación y empaquetado del vector AAV recombinante (Wu Zhijian et al., 1999).

Sin embargo, este virus recombinante tiene muchas deficiencias como vector de transferencia genética. En primer lugar, muchos virus de tipo salvaje se replican de forma tóxica en las células, lo que provoca su lisis y muerte, o transportan oncogenes virales para transformar las células; Por lo tanto, debe convertirse en un virus con replicación deficiente y eliminarse el oncogén antes de que pueda usarse para terapia génica. En segundo lugar, la longitud del ADN extraño insertado es muy limitada, especialmente para virus con genomas más pequeños, como virus adenoasociados (AAV, 4,7 kb), retrovirus (8 a 10 KB) y adenovirus (36 kb). Los genes no se eliminan, la capacidad para insertar ADN extraño es muy pequeña. Por lo tanto, se deben eliminar más genes virales para dejar espacio para la inserción de ADN extraño de mayor tamaño. Para aumentar la capacidad del vector viral para insertar ADN extraño, podemos eliminar algunos o todos los genes esenciales excepto los genes innecesarios del virus, y las funciones de estos genes esenciales las proporciona a su vez el virus auxiliar o la línea celular de empaquetamiento.

Los vectores virales se pueden dividir a grandes rasgos en dos tipos:

Vectores virales recombinantes: este tipo de vector utiliza el genoma viral completo como objeto de transformación. El paso general es eliminar selectivamente algunos genes esenciales del virus, especialmente genes tempranos o genes tempranos, o controlar su expresión; las funciones de los genes esenciales faltantes las proporcionan las células transcomplementarias; Las regiones de genes virales no esenciales se reemplazan con unidades de expresión de genes exógenos; los elementos que actúan en cis necesarios para la replicación y el empaquetado viral permanecen sin cambios. Este vector normalmente inserta unidades de expresión de genes extraños en el genoma viral mediante recombinación homóloga. Por ejemplo, en el método de construcción de adenovirus recombinante tradicional, el casete de expresión de gen extraño se inserta en la secuencia homóloga de adenovirus del plásmido lanzadera (tal como pXCX2 o pFGdX1), y un plásmido auxiliar (un plásmido que contiene el genoma de adenovirus tal como JM17 o pbhg) se utiliza transfectar 293 células. Los adenovirus recombinantes que contienen genes extraños se obtienen mediante recombinación homóloga intracelular (Graham FL y Prevec L 1995).

Vectores virales sin genes virales: Estos vectores tienen diferentes nombres en diferentes sistemas de vectores virales. Para los adenovirus, generalmente se denomina mini-Ad; en el sistema de vector HSV, generalmente se denomina vector amplicón o vector plásmido. Los vectores AAV recombinantes también son vectores virales sin genes virales. Estos sistemas de vectores constan a menudo de plásmidos de vectores y sistemas auxiliares. Los plásmidos vectoriales recombinantes se componen principalmente de casetes de expresión de genes extraños, elementos que actúan en cis necesarios para la replicación y el empaquetado del virus y estructuras principales de plásmidos. El sistema accesorio incluye todos los elementos de acción trans necesarios para la replicación y el empaquetado viral. Con la ayuda de sistemas auxiliares, los plásmidos vectoriales recombinantes (con o sin estructura plasmídica) se empaquetan en cápsides virales en una forma específica (monocatenaria o bicatenaria, ADN o ARN) sin ningún gen viral. Las ventajas de este vector viral incluyen buena seguridad y gran capacidad. La desventaja es que a menudo se requiere que los virus auxiliares participen en el empaquetado del ADN vector, y es difícil separar los virus auxiliares de los virus portadores, lo que resulta en una contaminación por virus auxiliares en el producto final, afectando así su aplicación. De hecho, los vectores virales sin genes virales pueden verse como una atenuación extrema de los vectores virales recombinantes.

La Tabla 1 enumera varios elementos comunes que actúan en cis de los vectores virales y los métodos de empaquetamiento clásicos. Método de empaquetado clásico de elementos vectoriales que actúan en cis

Vectores retrovirales

1) Dos repeticiones terminales largas (LTR): contienen secuencias necesarias para la integración y regulación de la transcripción. Contienen un potenciador y un promotor de la transcripción;

2) sitio de unión del cebador de ARNt p;

3) secuencia señal de empaquetado ψ.

Transfectar el plásmido vector en una línea celular empaquetadora como PA317 que integre todos los genes esenciales (gag, pol, env), y obtener una línea celular productora de virus (VPC) mediante cultivo selectivo. Las células no se lisan y el virus se secreta continuamente en el sobrenadante del cultivo.

Vector de adenovirus

Dos repeticiones terminales invertidas (ITR);

Secuencia señal de empaquetamiento.

El plásmido vector y el plásmido auxiliar* * * se transfectaron en 293 células para obtener adenovirus recombinantes. El adenovirus recombinante infecta 293 células y las amplifica; las células se lisan después de cada infección.

Vectores virales asociados a adenovirus

Dos repeticiones terminales invertidas (ITR) incluyen el origen de la replicación viral, las señales de empaquetado y los elementos cis necesarios para la integración y el rescate.

Transfectar el plásmido vector AAV y el plásmido auxiliar en células 293 e infectarlas con virus auxiliar (adenovirus o virus del herpes simple).

Vector del virus del herpes simple

Origen de replicación de la señal de empaquetamiento del virus OriHSV.

El virus recombinante PTCA se propaga en células complementarias;

El virus amplicón se transmite en presencia de virus auxiliar.

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Sección 2: Sistema de empaquetado de vectores virales

El empaquetado de genes extraños en partículas de cáscara viral es la tecnología central de la producción de vectores virales. Generalmente, la preparación de vectores virales incluye los siguientes elementos:

Células huésped

Aunque ahora es posible empaquetar algunos vectores virales (como los vectores) in vitro (libres de células) (Zhou et al. 1998; Ding L et al. 1997), pero este sistema de envasado aún requiere líquido de extracción celular y la eficiencia del envasado es bastante baja, lejos de alcanzar el nivel de producción. Hasta la fecha, el empaquetado de vectores virales se ha realizado principalmente en células huésped sensibles a virus. Las células huésped no sólo proporcionan las condiciones ambientales para la replicación y el empaquetado del virus, sino que muchos componentes celulares están directamente involucrados en el proceso de replicación y empaquetado del virus.

Elementos que actúan en cis y casetes de expresión de genes extraños necesarios para la replicación y el empaquetado del virus

Elementos que actúan en cis y casetes de expresión de genes extraños necesarios para la replicación y el empaquetado del virus Generalmente, son transportados por plásmidos bacterianos para formar plásmidos de vectores virales, que son objetos de empaquetamiento. Debido a las diferencias en la forma en que se replican los virus, cuando se empaquetan algunos vectores virales, como los amplicones del virus del herpes simple, todo el plásmido del vector se empaqueta en partículas virales. Sin embargo, algunos vectores virales, como los retrovirus y los vectores de virus asociados a adenovirus, no están empaquetados en partículas virales. Sólo los elementos que actúan en cis y los casetes de expresión de genes extraños necesarios para la replicación y el empaquetado del virus están empaquetados en partículas virales.

Cuando se construye un vector viral recombinante, los elementos que actúan en cis necesarios para la replicación y el empaquetamiento viral están presentes en el genoma viral (el genoma viral puede ser proporcionado por partículas de virus infecciosos o plásmidos).

En primer lugar, el casete de expresión del gen extraño se inserta en la secuencia homóloga viral transportada por el plásmido lanzadera recombinante en la célula y luego se sobreinfecta con el virus auxiliar o se transfectan el plásmido lanzadera recombinante y el plásmido del genoma viral; la célula; recombinación Los plásmidos y los genomas virales experimentan recombinación homóloga en las células para producir virus recombinantes que expresan genes extraños. De esta manera se han preparado adenovirus recombinantes (Graham FL y Prevec L 1995) y virus del herpes simple recombinante (pylesrb et al. 1997; Kramm CM et al. 1997).

Para hacer más cómoda la producción de vectores virales, los elementos que actúan en cis y los casetes de expresión de genes extraños necesarios para la replicación y el empaquetado del virus no sólo pueden ser transportados por plásmidos, sino también por otro virus ( generalmente virus auxiliares) o células productoras.

Elementos auxiliares

Contiene todos los elementos de acción trans necesarios para la replicación y el empaquetado viral. Estos elementos generalmente incluyen genes reguladores de la transcripción de genes virales, genes de diversas enzimas necesarias para la síntesis y empaquetamiento del ADN viral y genes de proteínas de cubierta viral. Los elementos auxiliares pueden adoptar muchas formas. Las formas comúnmente utilizadas son:

(1) Plásmido auxiliar, como el plásmido JM17 para producir adenovirus recombinantes, plásmido auxiliar PAAV/AD para empaquetar AAV recombinante (Rolling F y Samulski j 1995);

(2) virus auxiliar, como la cepa HSV1 tsK del virus auxiliar utilizada para el empaquetado del vector amplicón del HSV

③ Líneas celulares de empaquetado, como las células PA317 utilizadas para el empaquetado del vector retroviral;

Estas expresiones pueden transformarse o integrarse entre sí. Por ejemplo, los virus auxiliares se pueden convertir en plásmidos auxiliares: en los sistemas tradicionales de producción de vectores AAV, los adenovirus se utilizan a menudo como virus auxiliares. Se ha descubierto que no todos los genes de adenovirus son necesarios para la producción de virus AAV, sólo se requieren cinco genes de adenovirus E1a, E1b, E2a, E4 y Varner. Por lo tanto, el nuevo plásmido auxiliar construido al colocar estos cinco genes en el mismo plásmido puede reemplazar completamente el virus auxiliar original (Xiao X et al. 1998; Grimm D et al. 1998), lo que no solo mejora la eficiencia del empaque, sino que también evita el producto. residuos.

Diferentes combinaciones de los elementos anteriores dan lugar a diversas estrategias de empaquetado de vectores virales. Según el número de componentes de los sistemas de producción de vectores virales, se pueden dividir en las siguientes categorías:

Sistemas monocomponente:

Todos los componentes se concentran en la unidad de producción. El sistema de producción de retrovirus clásico consta de células productoras de virus (VPC), y el retrovirus recombinante se secreta continuamente en el sobrenadante del cultivo a través de las células VPC. Este sistema de producción es el más sencillo de operar, pero la producción suele ser baja o inestable. Con esta estrategia, es necesario colocar de manera estable en las células productoras todos los componentes necesarios para la producción de virus recombinantes. Esta estrategia es difícil de implementar en la producción de muchos vectores virales porque muchos productos genéticos virales son destructivos para las células o no pueden expresarse de manera estable en las células.

Sistema de producción de dos componentes

Este sistema de producción generalmente consta de "un virus/una célula". Un ejemplo típico es el sistema de producción de adenovirus recombinantes. Primero, la cepa de adenovirus recombinante se obtiene mediante transfección * * *, y luego la cepa y las células de producción (como las células 293) forman un sistema de producción de doble factor para amplificar el virus en grandes cantidades.

Sistema de producción multicomponente

Es un sistema de producción compuesto por más de dos componentes. El sistema tradicional de producción de vectores AAV consta de cuatro factores: plásmido vector, plásmido auxiliar, virus auxiliar y células de producción. Las desventajas de esta estrategia son que hay muchos factores que influyen, operaciones complejas y producción inestable, lo que no favorece la producción a gran escala. Los sistemas de producción anteriores también pueden transformarse entre sí. Nuestro laboratorio fusionó los cuatro factores del sistema de producción de vectores de AAV mencionado anteriormente en pares, es decir, fusionó el plásmido auxiliar y el virus auxiliar en un virus auxiliar recombinante, y fusionó el plásmido vectorial y las células de producción en una cepa de células provirales de AAV, con éxito. transformándolo en un nuevo y eficiente sistema de producción de componentes duales (Wu Zhijian et al., 1999).

En términos generales, el desarrollo de nuevas estrategias de empaque tiene principalmente los siguientes propósitos:

(1) Reducir los componentes en el sistema de producción y simplificar el proceso operativo;

(2) Mejorar la eficiencia de la producción y reducir los costos de producción;

(3) Evitar o reducir la producción de virus de tipo salvaje;

(4) Evitar el uso de ayuda virus que son difíciles de separar del virus del producto.

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Sección 3: Métodos de purificación de vectores virales

Existen muchas similitudes y diferencias entre la purificación de virus recombinantes y la purificación por ingeniería genética. productos. Los virus pueden considerarse como macromoléculas biológicas con una estructura específica, que generalmente consta de un ácido nucleico en el centro y una capa de proteína que lo rodea. Algunos virus también tienen membranas lipídicas y glicoproteínas o glicolípidos. Para la purificación de virus se pueden utilizar muchos métodos para aislar y purificar proteínas, como centrifugación y centrifugación en gradiente, sal, cromatografía en columna, ultrafiltración y diálisis. Sin embargo, debido a la complejidad de la estructura viral, la desnaturalización y renaturalización de proteínas no se pueden utilizar para la purificación, porque una vez que se desnaturaliza la proteína viral o se destruye la estructura viral, es difícil reconstruirla en partículas virales infecciosas in vitro. Por lo tanto, durante la purificación del virus, es necesario mantener la integridad de la estructura del virus y controlar su actividad infecciosa.

La purificación de virus se divide generalmente en los siguientes pasos:

Recogida o preparación de materias primas.

Se adoptan diferentes métodos dependiendo de cómo se genera el virus. Para los virus que no causan patología ni muerte celular, como los retrovirus, el sobrenadante del cultivo de células productoras de virus (células VPC) se puede recolectar continuamente como material de partida para los virus que causan enfermedades y muerte de las células huésped durante la producción del virus; En un proceso como el adenovirus, cuando la producción de virus alcanza su punto máximo, se recoge el sobrenadante del cultivo y se lisan las células para liberar el virus en las células.

Tanto los sobrenadantes de cultivos como los lisados ​​celulares se pueden utilizar como materiales de partida para la purificación. En la preparación de laboratorio a pequeña escala, el lisado celular a menudo se prepara utilizando células como material de partida y congelando y descongelando repetidamente el sobrenadante del cultivo de 3 a 4 veces. Para la preparación a gran escala de materiales de partida con un volumen superior a 500 ml, es necesario considerar las proporciones de pérdidas y ganancias de diferentes materiales de partida. Si la mayor parte (más del 90%) del virus objetivo todavía está presente en las células durante la recolección, para reducir los inconvenientes causados ​​por el procesamiento de grandes volúmenes de materiales de partida, puede considerar descartar el virus objetivo contenido en el sobrenadante, recolectar el células mediante centrifugación a baja velocidad y repetir. Suspender las células en un pequeño volumen de tampón para lisarlas y preparar un lisado celular. Este método se puede utilizar para la preparación a gran escala de adenovirus y virus AAV. Si la mayor parte del virus objetivo se puede liberar en el medio de cultivo ampliando el tiempo de cultivo, sólo se puede recoger el sobrenadante del cultivo y desechar las células, eliminando así la necesidad de repetir los pasos de congelación y descongelación.

Además de los métodos repetidos de congelación y descongelación, se pueden utilizar otros métodos que no afecten a la infectividad del virus objetivo en función de sus características biológicas, como los métodos ultrasónicos y los métodos químicos (como el ácido desoxicólico o cloroformo utilizado en la preparación del virus AAV).

Concentración de materiales de partida

Cuando el volumen de materiales de partida es grande, se debe concentrar antes de la separación y purificación. Es mejor obtener efectos de purificación preliminares mientras se concentra. Sin afectar la infectividad del virus objetivo, se pueden seleccionar métodos como sal, ultrafiltración y diálisis para la concentración. El método de sal no sólo se puede utilizar para concentrar la sustancia inicial, sino también para lograr un cierto efecto de separación y purificación. La sal más utilizada es el sulfato de amonio; el sistema de polietilenglicol/cloruro de sodio puede precipitar muchos virus, como el adenovirus, el virus AAV, el virus del herpes simple, etc., y puede lograr buenos resultados sin afectar la infectividad del virus.

Aislamiento y purificación de virus diana

La centrifugación en gradiente de densidad con cloruro de cesio sigue siendo el método más utilizado para aislar y purificar varios virus. Se basa principalmente en la densidad flotante característica de diferentes virus para separarlos de otros componentes del lisado celular. Después de recolectar componentes específicos del virus objetivo, el cloruro de cesio se elimina mediante diálisis para obtener virus purificado. A veces se pueden obtener virus de pureza extremadamente alta utilizando este método. La mayoría de los adenovirus recombinantes utilizados actualmente en experimentos clínicos se purifican mediante este método. Sin embargo, este método también tiene desventajas obvias, principalmente el uso lento, la operación difícil y la mala repetibilidad. El cloruro de cesio es tóxico para el cuerpo humano; Por lo tanto, con el desarrollo de la investigación y las aplicaciones de la terapia génica, es posible que los virus recombinantes purificados mediante este método no cumplan con los requisitos para aplicaciones humanas.

El uso de la cromatografía en columna, especialmente la cromatografía de afinidad, para separar y purificar virus puede convertirse en la dirección principal para purificar grandes cantidades de vectores virales recombinantes para uso clínico. Los receptores específicos, anticuerpos o ligandos del virus sintetizados químicamente se acoplan a la matriz de cromatografía para formar una columna de cromatografía de afinidad. Después de un procesamiento simple, el material inicial que contiene el virus objetivo se carga directamente en la columna y finalmente el virus objetivo se eluye para recolectar el virus objetivo. Recientemente, este método ha sido altamente evaluado en la purificación de vectores virales de AAV (Summerford C y Samulski J 1999).

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Sección 4 Aplicación de vectores virales en terapia génica

Desde que en 1989 se realizó la primera transferencia genética humana (gen marcador), Según Según estadísticas incompletas, hasta ahora se han llevado a cabo casi 400 ensayos clínicos de terapia génica, en los que han participado más de 1.000 pacientes. Más de 2/3 de los proyectos clínicos utilizan vectores virales para la entrega de genes.

Dado que los distintos vectores virales tienen sus características biológicas específicas, estas características determinan su aplicación en terapia génica.

La Tabla 2 enumera las características y el ámbito de aplicación de los vectores virales comúnmente utilizados, así como los métodos clásicos de empaquetado de los elementos que actúan en cis del vector.

Vectores retrovirales

1) Dos repeticiones terminales largas (LTR): contienen secuencias necesarias para la integración y regulación de la transcripción; contienen potenciadores y promotores de la transcripción;

p; >

2) Sitio de unión del cebador de ARNt p;

3) Secuencia señal de empaquetado ψ.

Transfectar el plásmido vector en una línea celular empaquetadora como PA317 que integre todos los genes esenciales (gag, pol, env), y obtener una línea celular productora de virus (VPC) mediante cultivo selectivo. Las células no se lisan y el virus se secreta continuamente en el sobrenadante del cultivo.

Vector de adenovirus

Dos repeticiones terminales invertidas (ITR);

Secuencia señal de empaquetado.

El plásmido vector y el plásmido auxiliar* * * se transfectaron en 293 células para obtener adenovirus recombinantes. El adenovirus recombinante infecta 293 células y las amplifica; las células se lisan después de cada infección.

Vectores virales asociados a adenovirus

Dos repeticiones terminales invertidas (ITR) incluyen el origen de la replicación viral, las señales de empaquetado y los elementos cis necesarios para la integración y el rescate.

Transfectar el plásmido vector AAV y el plásmido auxiliar en células 293 e infectarlas con virus auxiliar (adenovirus o virus del herpes simple).

Vector del virus del herpes simple

Origen de replicación de la señal de empaquetamiento del virus OriHSV.

El virus recombinante PTCA se propaga en células complementarias;

El virus amplicón se transmite en presencia de virus auxiliar.

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Sección 5 Control de seguridad

En términos generales, las pruebas de seguridad de preparaciones de vectores virales implican principalmente los siguientes aspectos (Adelson RW1996):

Virus competente para la replicación (RCV)

El RCV generalmente resulta de eventos de recombinación genética durante la producción de virus recombinantes. Dado que RCV tiene la capacidad de replicarse, una vez que aparece durante el proceso de producción, puede mostrar un crecimiento dominante, afectando así el rendimiento de los virus vectores. Además, los productos que contienen RCV pueden causar infecciones virales graves o infecciones agudas/crónicas cuando se usan en el; cuerpo humano.

RCV es un proyecto especial para comprobar la seguridad de preparados de vectores virales utilizados en terapia génica. Los métodos para detectar RCV varían según los diferentes vectores virales. Para los vectores retrovirales, el método principal para detectar retrovirus con capacidad de replicación (RCR) es el ensayo PG4 S+L. También son posibles otras alternativas. Para los vectores de adenovirus, el análisis de placas y la PCR se utilizan principalmente para detectar adenovirus en replicación (RCA).

Virus auxiliares

Para los vectores virales que requieren que los virus auxiliares participen en el proceso de producción, como los vectores virales AAV, es muy importante detectar la cantidad residual de virus auxiliares como adenovirus o virus del herpes simple en preparaciones de virus Debido a que estos virus auxiliares tienen la capacidad de replicarse, son destructivos para las células del cuerpo.

Contaminación de otros componentes

Los indicadores de prueba incluyen bacterias, moho, micoplasmas, endotoxinas y cantidades residuales de reactivos utilizados en el proceso de purificación, como el cloruro de cesio.

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Sección 6: Dirección del desarrollo de vectores virales

El rápido desarrollo de la investigación en terapia génica ha impuesto demandas cada vez mayores a los sistemas de introducción de genes. El desarrollo de vectores virales también está cambiando cada día que pasa, incluida la mejora continua y el perfeccionamiento de los vectores virales existentes, y cada vez más virus se transforman en nuevos vectores virales. La dirección del desarrollo de los vectores virales se puede resumir como:

Sistema de empaquetado de vectores virales simple y eficiente: considerando la alta eficiencia del empaquetado y la facilidad de operación, cada vez más sistemas de producción de vectores virales adoptarán sistemas de dos componentes. .

Este sistema es fácil de usar para la producción en masa de vectores virales (los elementos que actúan como Liu Cis y necesarios para el empaquetado son una importante dirección de desarrollo de los vectores virales). Esta estrategia puede maximizar la capacidad del vector y reducir la toxicidad directa del virus a las células y la inmunotoxicidad causada por la expresión de proteínas virales. Los microvectores de adenovirus (mini-Ad), los vectores de AAV y los vectores amplicones de HSV son todos vectores virales sin genes virales. El principal problema a resolver en esta dirección de desarrollo es establecer un sistema de envasado eficiente y seguro (sin contaminación de virus auxiliares).

Vectores virales que pueden regular la expresión de genes extraños: En la terapia génica de muchas enfermedades, es muy importante conseguir la expresión regulada de genes extraños. Por ejemplo, en la terapia génica para la diabetes, la expresión de genes exógenos de insulina está regulada por los niveles de glucosa en sangre. En la terapia génica para la anemia renal, la expresión del gen EPO debe estar regulada por el contenido de oxígeno en sangre. Los sistemas de control de expresión actualmente estudiados incluyen principalmente "cambios" de expresión inducidos por diversos fármacos. El sistema regulador de tetraciclina (Tet-on y Tet-off) es un modelo de regulación de la expresión genética diseñado artificialmente. Este sistema ha mostrado una buena regulación de la expresión en experimentos in vitro e in vivo (Fotaki ME et al. 1997; Miller N y Whelan J 1997). Sin embargo, las proteínas de acción trans (tTA o rtTA) son proteínas heterogéneas y pueden causar toxicidad in vivo. efectos y respuestas inmunes, por lo que se debe considerar su seguridad y efectividad a largo plazo antes de su uso en humanos.

Recientemente, Binley K et al. (1999) informaron del uso de elementos de respuesta a la hipoxia para expresar genes extraños (HRE) en vectores de adenovirus. La hipoxia puede activar la expresión de factores de transcripción de la familia bHLH/PAS, que pueden unirse a la secuencia central de HRE e inducir la expresión de sus genes posteriores.

Vector autoamplificador (Herweijer H y Wolff Ja1997): En la actualidad, la eficiencia de la transferencia génica es todavía relativamente baja, especialmente in vivo. Para aumentar el nivel general de expresión de genes exógenos, además de mejorar la eficiencia de la transferencia de genes, otro método consiste en aumentar el nivel de expresión del ADN exógeno en las células tanto como sea posible. El uso de vectores de expresión autoexpandibles es una forma de lograr este objetivo. Estos vectores se basan en los virus de ARN de cadena positiva, el virus Sindbis y el virus Semliki Forest. El gen diana reemplaza la secuencia codificante de la proteína de cubierta viral y se introduce en la célula diana. La proteína de replicación viral replica grandes cantidades del genoma recombinante y un gran aumento en los niveles de ARNm da como resultado una expresión de alto nivel de genes transductores. Los vectores autoamplificadores pueden expresarse en ARN, ADN y virus recombinantes.

Vector de replicación específico: se refiere a un vector viral que puede producir replicación tóxica en un determinado tejido pero no prolifera en otros tejidos. Este tipo de vector viral se utiliza principalmente para lisar específicamente células tumorales. Por ejemplo, el adenovirus mutante Onyx-015 es un adenovirus mutante con una deleción del gen E1B de 55 Kdal. Puede proliferar selectivamente en células tumorales con genes p53 mutados, pero no puede proliferar en células de tejido normal. Los resultados clínicos del uso de este mutante en combinación con quimioterapia para tratar tumores malignos son alentadores (Kirn D et al. 1998), y ahora ha entrado en ensayos clínicos de fase III. Desde entonces, se han utilizado muchos mutantes de adenovirus modificados artificialmente en la investigación del tratamiento de tumores. Por ejemplo, si la expresión del gen E1 del adenovirus está controlada por el promotor de la alfafetoproteína (AFP), el virus sólo puede proliferar en células de cáncer de hígado positivas para la alfafetoproteína y provocar la muerte celular. El genoma de este virus también se puede separar en dos vectores de adenovirus defectuosos complementarios (Alemany R et al. 1999), uno de los cuales contiene sólo el gen de la región E1, E1A, además de los elementos que actúan en cis necesarios para la replicación y el empaquetado del adenovirus. La expresión del gen está controlada por el promotor AFP; otro vector es un adenovirus recombinante que tiene delecionada la región E1. Cuando estos dos vectores infectan simultáneamente células de cáncer de hígado positivas para AFP, el virus puede proliferar y provocar la muerte celular. En las células AFP negativas, el gen E1A no se expresa, por lo que el virus no puede proliferar. También se han informado diseños similares en sistemas de vectores HSV. Además de la alfafetoproteína como transactivador, se pueden utilizar una variedad de otras proteínas y secuencias reguladoras específicas de tejido para controlar la proliferación viral.

Los vectores virales híbridos se refieren a virus híbridos recombinantes formados combinando los elementos genéticos de diferentes virus.

Por ejemplo, un virus híbrido entre adenovirus y virus AAV tiene tanto la infectividad como las características genómicas (ADN lineal bicatenario) del adenovirus y la integración cromosómica del virus AAV (Lieber A et al. 1999). Hay un sinfín de informes sobre la combinación de diversos elementos genéticos virales para formar nuevos vectores híbridos, tales como vectores híbridos del amplicón del virus del herpes simple y del virus AAV (Johnston KM et al. 1997), vectores híbridos del replicón del virus de Epstein-Barr y adenovirus (Tan BT et al. 1999), adenovirus y vectores híbridos retrovirales (Caplen NJ et al. 1999). Estos vectores híbridos diversifican las propiedades de los virus recombinantes para satisfacer las necesidades de diferentes propósitos de transferencia de genes.

Los vectores virales dirigidos se refieren a vectores virales que pueden unirse específicamente a ciertas células e infectarlas. Hay dos enfoques principales para generar vectores virales específicos. Un método consiste en acoplar partículas virales con moléculas objetivo (Harari OA et al. 1999) o anticuerpos específicos (Bartlett JS et al. 1999); otro método consiste en cambiar la estructura de la proteína de la cubierta viral para cambiar su tropismo por las células (Reynolds); P et al 1999; Krasnykh VN et al 1996).

Referencias

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Lieber A, Steinwaerder. DS, Carlson CA y otros, 1999. Integra un vector híbrido adenovirus-virus adenoasociado que carece de todos los genes virales. 73:9314-9324

Liu XL, Clark KR, Johnson PR. 1999. Producción de vectores de virus adenoasociados recombinantes utilizando líneas celulares empaquetadoras y adenovirus recombinantes híbridos. Terapia genética. 6:293-299

Miller N y Whelan J. 1997. Avances de la investigación sobre la dirección de la transcripción y los vectores reguladores en terapia génica. bufido. Terapia genética. 8:803-815

Pyles RB, Warnick RE, Chalk CL et al. 1997 Una nueva cepa multimutante de HSV-1 para el tratamiento de tumores cerebrales humanos. bufido. Terapia genética. 8:533-544

Reynolds P, Dmitrev I, Kuliair D 1999. La inserción del motivo RGD en el bucle HI de la proteína de la fibra de la cola adenoviral altera la distribución de la expresión transgénica de los vectores administrados sistémicamente.

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