Proceso de inmunohistoquímica

Protocolo de inmunohistoquímica

1. Perfusión y extirpación del cerebro

Los ratones se perfundieron a través del ventrículo izquierdo (se cortó la orejuela auricular derecha) y se enjuagaron con 40-50 ml de normal. solución salina a 37 grados Celsius, 40 ml de perfusión de paraformaldehído (el proceso de perfusión es rápido primero, luego lento

2. Retire el cerebro y colóquelo en una solución de 4-paraformaldehído, y luego fíjelo durante 24 horas). horas;?

3. Después de la postfijación, deshidratar con solución de sacarosa al 15% durante 24 horas y luego deshidratar con solución de sacarosa al 30% durante 48 horas. Una vez completado, coloque el pañuelo en una caja pequeña y luego colóquelo en una taza pequeña de nitrógeno líquido durante 10 a 20 segundos (el tejido no entra en contacto con el nitrógeno líquido), saque el pañuelo y guárdelo en un - Refrigerador a 80 grados Celsius para su uso posterior, o colóquelo en un microtomo de congelación para su uso posterior.

2. Seccionamiento

1. Saque el tejido del refrigerador a -80°, inclúyalo y colóquelo en un microtomo de congelación a -20° para recalentarlo;

2. Corte rodajas de cerebro con un grosor de 10-20 μm (no manche inmediatamente después del corte, debe secarse; se puede conservar en un refrigerador a 4°C a baja temperatura).

3. Reacción antígeno-anticuerpo y tinción

1. Enjuague las rodajas de cerebro con PBS 3 veces*5 min (para eliminar el agente de inclusión);

2. Uso Incubar las rodajas de cerebro con 5H2O2 (preparadas para su uso) a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos, y enjuagar nuevamente con PBS durante 3*5 minutos.

3. Bloqueo: 5 sueros (o; use BSA) e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos (selección de suero y secundario (la fuente del anticuerpo es la misma), sacuda el exceso de líquido sin lavar;

4. Agregue el anticuerpo primario gota a gota, colóquelo en una caja humidificada e incúbelo a 4°C durante la noche (o siga las instrucciones para la concentración recomendada y las condiciones de incubación);

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9. Sáquelo al día siguiente e incúbelo a temperatura ambiente durante 2 horas, enjuague con PBS durante 3*5 minutos;

9. Agregue el anticuerpo secundario gota a gota e incúbelo a temperatura ambiente durante 2 horas (o siga las instrucciones para recomendar la concentración e incubación). condiciones ), enjuague con PBS durante 3*5min;

10. Agregue el complejo ABC gota a gota (4°C, listo para usar) e incube a temperatura ambiente durante 2 horas, enjuague con PBS durante 3*5min;

11. Añadir gota a gota el cromógeno DAB (sacar previamente del frigorífico a -20° para recalentar) y reaccionar en la oscuridad durante 30 minutos, enjuagar con PBS durante 3*5 minutos;

12. Después de teñir con hematoxilina (se puede reciclar) durante 3 segundos, use agua del grifo. Enjuague hasta que esté limpio (al menos >3 veces)

13. Deshidratación en gradiente de etanol 75 (1 min) → 95 (1 min). ) → 100 (1min)

14. Xileno transparente (2min)

15. Colóquelo sobre papel de filtro, deje caer una pequeña cantidad de resina neutra en el centro para sellarlo, cubra cúbralo con un cubreobjetos (para expulsar las burbujas de aire) (manténgalo en posición horizontal) y guárdelo en un lugar fresco y ventilado. (Si hay exceso de resina, puede utilizar un bastoncillo de algodón humedecido en xileno para frotar)

IV Procesamiento de imágenes

1. Observación microscópica

2. Imágenes de inmunohistoquímica Se utilizó el software Image-Pro-Plus para contar placas de Aβ y astrocitos en el hipocampo del ratón.

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