La secuenciación del transcriptoma completo construye una red reguladora de ARNce en ratas HPH
Medios técnicos: secuenciación del transcriptoma completo
Parseno Bio cooperó con la Universidad Médica de Kunming y publicó recientemente en Genomics un método para construir una red reguladora de ARNce para la hipertensión pulmonar hipóxica en ratas. Los resultados tienen un factor de impacto de 6,2.
Antecedentes de la investigación
La hipertensión pulmonar hipóxica (HPH) es una lesión de las células endoteliales vasculares causada por la hipoxia. El desequilibrio de los factores de relajación sintetizados y secretados por el endotelio vascular conduce a una enfermedad pulmonar temprana. vasoconstricción y remodelado vascular pulmonar tardío. Es una complicación reconocida de la enfermedad pulmonar hipóxica crónica y la incidencia de HPH aumenta año tras año, especialmente en áreas de gran altitud. En la actualidad, el pronóstico de la HPH es malo y es de gran importancia explorar posibles o nuevos tratamientos farmacológicos dirigidos.
El ARN circular (circRNA) es un tipo especial de ARN no codificante que se caracteriza por una estructura de anillo cerrado y, por tanto, es más estable que la mayoría de los ARN lineales tradicionales. Los estudios han demostrado que el circRNA contiene múltiples sitios de unión para miRNA y puede actuar como una esponja para miRNA, regulando así la expresión de sus genes diana posteriores mediante la inhibición de miRNA. Este proceso es el mecanismo competitivo de ARN endógeno (ARNce). Hasta ahora, se ha descubierto que algunos circRNA desempeñan un papel en la regulación de señales de las células cancerosas a través de la red de ceRNA de circRNA-miRNA-mRNA, pero sus funciones y mecanismos en HPH no se han explorado completamente.
En base a esto, este experimento construyó un modelo de rata HPH, utilizando tecnología de secuenciación del transcriptoma completo, combinada con análisis de redes de interacción de proteínas, análisis de enriquecimiento de la función genética y otros métodos de análisis, para construir un ARNce de ARNm, ARNm y ARNm. red reguladora para explorar posibles genes clave en HPH.
Métodos de investigación
Muestras: tejido pulmonar de ratas modelo HPH y ratas control.
Método experimental: Secuenciación del transcriptoma completo.
Plataforma de secuenciación: ¿Illumina? Hiseq
La hoja de ruta tecnológica es la siguiente:
Resultados de la investigación
1 y análisis preliminar de los resultados completos de la secuenciación del transcriptoma
Seis muestras de Se secuenciaron los pulmones de ratón y de rata control. Después de la normalización de los datos, los conjuntos de datos de circRNA, miRNA y mRNA de las seis muestras fueron casi idénticos (Figura 1 A). Los resultados del análisis diferencial mostraron que, en comparación con el grupo de control, se identificaron un total de 15 ARN pequeños diferenciales (11 regulados positivamente, 4 regulados negativamente) y 9 ARN pequeños diferenciales (9 regulados negativamente) en el grupo HPH. 2 regulados negativamente) y 212 ARNm diferenciales (141 regulados positivamente, 71 regulados negativamente) (Fig. 1 B, c).
? ¿Figura 1? Identificación de cambios significativos en la expresión de ARN en el modelo de rata HPH
2. Construcción de una red de ARNce
A continuación, utilice herramientas en línea para predecir los genes objetivo de los miARN diferenciales. 8 circRNA diferenciales (6 (6 regulados positivamente, 2 regulados negativamente) pueden apuntar a 9 miRNA diferenciales (6 regulados positivamente, 2 regulados negativamente). Además, estos miARN diferenciales pueden unirse a 46 ARNm diferenciales (27 regulados positivamente y 19 regulados negativamente) (Tabla 1). Con base en los pares de relaciones circRNA-miRNA y miRNA-mRNA predichos, se construyó una red de ceRNA (Figura 2 A).
¿Tabla 1? Genes diana de ARN expresados diferencialmente
Un análisis más detallado de la red de ARNce mostró que circ_002723, circ_008021 y circ_016925 (regulados positivamente) se combinaron con miR-23a (regulado negativamente), que se confirmó que estaba involucrado en enfermedades cardíacas congénitas. enfermedad e hipoxia Desarrollo de hipertensión pulmonar asociada con la inducción de células del músculo liso de la arteria pulmonar humana. Además, circ_020581 (regulación negativa) se combina con miR-21 (regulación positiva). Los experimentos in vivo en ratones muestran que la eliminación del gen de miR-21 conducirá a la activación funcional del eje PDCD4/caspasa-3 en el tejido pulmonar y la inhibición de la apoptosis de las células endoteliales, lo que conduce a la aparición de HPH progresiva.
Por lo tanto, se puede inferir que circ_002723, circ_008021, circ_016925 y circ_020581 tienen la función potencial de adsorber específicamente miR-23a o miR-21 para controlar la expresión de genes diana posteriores en HPH.
3. Análisis rico en funciones y análisis PPI.
Utilice el software en línea Metascape para realizar análisis de enriquecimiento GO y KEGG en 46 ARNm diferenciales en la red de ARNce. Los resultados mostraron que algunos elementos y vías enriquecidos estaban relacionados con HPH (Figura 2 B):
? ¿Foto dos? Diagrama de red CeRNA, diagrama de red de análisis de enriquecimiento, diagrama de red PPI.
a. El enriquecimiento con GO muestra que los genes diferenciales se enriquecen significativamente en los procesos del sistema respiratorio, la respuesta celular a la hiperoxia y la regulación de la respuesta inflamatoria. Además, el análisis de enriquecimiento KEGG mostró que los genes diferenciales se enriquecieron significativamente en la contracción del músculo liso vascular. Estudios anteriores han demostrado que la proliferación y migración anormales de las células del músculo liso de la arteria pulmonar pueden conducir a la remodelación vascular pulmonar, que es una característica importante de la patología de la hipertensión pulmonar. Además, la hipoxia crónica y la respuesta inflamatoria pueden inducir la proliferación y migración de las células del músculo liso de la arteria pulmonar y se consideran factores importantes en la promoción de la HPH.
B. Al mismo tiempo, los genes diferenciales también están significativamente enriquecidos en la regulación de la señal NIK/NF-κB de GO, la reacción en cascada MAPK y las entradas del receptor tipo Toll, que se ha informado muchas veces que están estrechamente relacionadas. relacionado con HPH.
c.Además, los resultados del análisis de enriquecimiento de GO mostraron que las células respondieron al redox. Se sabe que los oxidantes y las señales redox median la vasoconstricción hipóxica en las arterias pulmonares y la vasodilatación hipóxica en las arterias sistémicas, participando así en el desarrollo de la hipertensión pulmonar.
d. Finalmente, la vía de señalización de BMP apareció en los resultados del análisis de enriquecimiento de KEGG. Los datos clínicos muestran que alrededor del 11% al 40% de la hipertensión pulmonar (HP) idiopática tienen mutaciones en el gen BMPR2. También se ha informado que la inhibición de la vía de señalización de la proteína BMP puede promover la transición endotelial a mesenquimatosa de la HPH.
Además, se realizó un análisis de interacción de redes de proteínas (PPI) en 46 ARNm diferenciales en la red de ARNce y se encontraron 18 genes centrales, entre los cuales MMP8 tenía la mayor cantidad de conexiones (Figura 2 C). Las funciones enriquecidas de MMP8 incluyen la producción de citocinas, la transducción de señales NIK/NF-κB, la síntesis de ROS, la respuesta inflamatoria, la cascada MAPK, la producción de IL-10 y la secreción del factor de necrosis tumoral. La MMP desempeña un papel complejo e importante en el desarrollo y desarrollo de tumores. El papel de MMP8 en HPH merece más estudio.
Resumen
En este experimento, se secuenció todo el transcriptoma del modelo de rata HPH y se construyó una red reguladora de ARNce compuesta por 8 ARNcirc, 9 miARN y 46 ARNm. El enriquecimiento funcional mostró que la respuesta inflamatoria, la señalización de NF-κB, la cascada MAPK y los receptores tipo Toll estaban relacionados con HPH. Una evaluación adicional confirmó que circ_002723, circ_008021, circ_016925 y circ_020581 pueden usarse como esponjas para adsorber miR-23a o miR-21 para controlar genes diana posteriores y participar en la fisiopatología de HPH. Estos resultados pueden proporcionar nuevos conocimientos y posibles sugerencias de tratamientos específicos para uso clínico.
La secuenciación y el análisis de datos de este estudio fueron completados por Shanghai Paison Biotechnology Co., Ltd.
Enlace original: https://doi .org/10.1016/j . ygeno 2020.11.021 Secuenciación del transcrito completo para construir la red reguladora de ARNce en ratas HPH.