Descripción general del conocimiento técnico en inmunología Capítulo 2
Conceptos básicos de anticuerpos: anticuerpos policlonales (anticuerpos secretados por múltiples clones de linfocitos) y anticuerpos monoclonales (anticuerpos secretados por un único clon de linfocitos B).
Características de los anticuerpos monoclonales:
Altamente homogéneos (misma subclase), composición química uniforme, ninguna Ig o muy poca Ig.
Fuerte especificidad, dirigiéndose únicamente a un determinado epítopo.
Fuerte afinidad
La cantidad de antígeno es pequeña y no requiere purificación.
No hay diferencia entre lotes
Fuente estable, producción en masa, fácil de estandarizar.
No es fácil formar líneas de precipitación.
La operación es problemática.
¿En qué condiciones es necesario preparar anticuerpos monoclonales?
Las proteínas diana tienen estructuras similares.
El antígeno es impuro y no se puede separar.
Los anticuerpos policlonales no son eficaces (se han descartado reacciones inespecíficas)
Se espera que los anticuerpos puedan utilizarse para tratamientos y convertirse en fármacos.
Se espera que los anticuerpos puedan usarse para el diagnóstico y convertirse en reactivos de diagnóstico.
¿La primera sección? Diferencias de los anticuerpos policlonales
1. Principios de preparación de los anticuerpos policlonales
Preparación de anticuerpos, inmunización animal y purificación de anticuerpos.
2. Condiciones básicas para la resistencia multipartida
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Antígenos de partículas: células, virus, bacterias, etc. Generalmente, tiene una fuerte inmunogenicidad y puede inyectarse directamente en la cavidad abdominal sin agregar adyuvantes.
Antígeno soluble: La fuente del antígeno soluble es principalmente la purificación natural, o el gen diana se expresa en células procarióticas o eucariotas. Los antígenos solubles requieren una mezcla completa o incompleta con el adyuvante de Freund para la inmunización.
(1) Extracción completa de antígenos: disrupción celular, extracción de antígenos y purificación de antígenos.
(2) Reticulación de hapteno y portador: selección de portador, método de acoplamiento de hapteno y portador, identificación del complejo de acoplamiento.
(3) Síntesis de antígeno peptídico: selección de péptidos inmunogénicos, síntesis y purificación de péptidos.
2. Selección de animales inmunizados:
3. Preparación de adyuvantes:
Tipos de adyuvantes: auxiliares inorgánicos, auxiliares orgánicos, agente auxiliar sintético, agente oleoso .
3.Métodos básicos de preparación de anticuerpos policlonales
1.? Determinación de antígenos, vías de inmunización y procedimientos de inmunización
Métodos para inmunizar animales:
El valor inmunógeno es:
Inmunización sin adyuvantes: adecuado para antígenos en partículas p> p>
Inmunoensayo adyuvante de Freund: adecuado para antígenos solubles
Inmunidad adyuvante de aluminio: adecuado para inmunidad humana
Animales inmunes (generalmente elegir hembras, dóciles y capaces de producción)
Vacunación intradérmica
Vacunación subcutánea o intramuscular
Vacunación ganglionar
Método mixto
Gotas de anticuerpos Después de la Si el paciente está satisfecho, se le administra una inyección intravenosa de refuerzo inmunológico.
Métodos de inyección comunes; inyección subcutánea, inyección intradérmica, inyección en la vena de la cola, inyección intravenosa
2. Prueba de muestra de sangre y extracción de sangre
Obtención de antisuero: orbital, extracción de sangre carotídea y cardíaca.
Evaluación del efecto inmunológico: extracción de sangre (arteria de oreja de conejo, vena de cola de ratón) y detección (método de inmunodifusión bidireccional, ELISA)
Tecnología de purificación y aislamiento de anticuerpos.
Método de sal, método de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y método de separación electroforética.
El principio de la cromatografía de afinidad: la unión específica entre proteínas (antígeno-anticuerpo, receptor-ligando) se utiliza para unir un ligando a las partículas del gel y capturar el ligando que coincide con él, eluyendo otra sustancia. , generalmente cambiando el pH.
Los pasos principales son: combinar la proteína con la columna de activación, procesar la ascitis o el suero, pasar a través de la columna, lavar la columna con tampón de unión (se sabe que A280 es cero), eluir el anticuerpo con el aminoácido Yongan tampón y recoja cantidades iguales de eluato, mida el valor de A280 del eluato y retenga muestras con valores de A280 significativamente elevados.
4. Identificación de anticuerpos
Determinación de la concentración de proteínas: espectrofotometría UV, método biuret, método furinol,
Evaluación del efecto inmunológico: Inmunodifusión bidireccional y ELISA .
Análisis de pureza: Western blot (WB)
Análisis de categoría de anticuerpos: tiras reactivas Immunogold
Análisis de afinidad: ELISA, polarización de fluorescencia
5.? Preservación de anticuerpos
Concentración de anticuerpos: absorción, evaporación y ultrafiltración.
Conservación de anticuerpos: conservante concentrado de glicerina
Las razones del efecto inmunológico deficiente pueden ser: pureza insuficiente del antígeno, baja inmunogenicidad, emulsificación no calificada de la vía inmune y dosis inmune inadecuada. las enfermedades animales o las diferencias entre especies son pequeñas.
¿Segunda parte? Tecnología de preparación de anticuerpos monoclonales
1. Principio de preparación de anticuerpos monoclonales
1 célula B solo puede producir 1 anticuerpo. Métodos: Se utilizó hibridación por ingeniería celular y tecnología de hibridoma de células B.
Las células B monoclonales deben combinarse con células tumorales para producir anticuerpos monoclonales de forma permanente.
Barski et al. descubrieron el fenómeno de la fusión natural de células en la región frontal, pero la frecuencia era muy baja.
Okada et al. descubrieron que Sendai Endowment y el polietilenglicol pueden mejorar significativamente la eficiencia de la fusión celular.
2. Condiciones básicas para la preparación de anticuerpos monoclonales
Es necesario cultivar células B normales y células tumorales fusionadas con células B.
1. Antígenos y vectores de inmunización animal, selección de animales, vías de inmunización
Por ejemplo: inmunización en ratón
Primera inmunización: antígeno soluble más Adyuvante completo de Freund - subcutáneo inyección en el lomo de ratones (después de 4 semanas)
Segunda inmunización: antígeno soluble más adyuvante incompleto de Freund - inyección subcutánea en el lomo de ratones (después de 3 semanas)
La tercera inmunización : antígeno soluble más solución salina normal - inyección intraperitoneal en ratones (título sérico detectado después de 10 días)
Mejorar la inmunidad: antígeno soluble más solución salina normal - inyección intraperitoneal en ratones (después de 3 días))
Fusión celular
2.? Cultivo de células de mieloma con deficiencia de enzimas
Vía de síntesis del ADN celular:
La hipoxantina (H) se sintetiza a través de la síntesis de purinas a HGPRT (hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa), luego se sintetizan los nucleótidos de guanina.
La timidina (T) sintetiza TK (timidina quinasa) a través de la vía de derivación de la síntesis de pirimidina y, además, sintetiza timidina desoxinucleótido.
Los aminoácidos, la glutamina y el monofosfato de guanosina se combinan con los nucleótidos de guanina y los desoxinucleótidos de timidina sintetizados en los dos pasos anteriores a través de la vía principal de la biosíntesis de ácidos nucleicos para formar ADN.
Si el extremo amino en el tercer paso se cambia a aminopterina (a), no se puede formar ADN.
Por lo tanto, la detección de células con deficiencia enzimática es la detección HAT.
3. Establecimiento de un método de detección de anticuerpos monoclonales
Tecnología de inmunoenzimas
Tecnología de inmunofluorescencia
Tecnología de inmunodifusión
3. Métodos básicos para la preparación de anticuerpos monoclonales
1. Cultivo de células de mieloma deficientes en enzimas
Condiciones básicas para el cultivo de tejidos:
Instrumentos: Incluye incubadora de CO2, invertida. microscopio, mesa limpia, tanque de nitrógeno líquido y centrífuga criogénica de baja velocidad.
Reactivos: medio de cultivo, medio selectivo HAT, medio HT, suero, antibióticos.
Consumibles: Placas de Petri, cultivos, pipetas y pipetas.
Puntos clave en la selección de líneas celulares de mieloma:
(1)? Las células de mieloma seleccionadas deben ser las mismas que las de la cepa animal que proporcionó las células inmunes del bazo.
(2)? No produce cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas.
(3)? ¿Sensible a la aminopiridina?
(4)? Después de la fusión con las células inmunes del bazo, se producen células híbridas de Ig secretoras estables.
2. Preparación de las células alimentadoras
Las funciones de las células alimentadoras: (1) Aumentar la densidad celular para satisfacer los requisitos de las nuevas células de hibridoma.
(2)? Fagocitosis de células muertas
(3)? Secreción de factores estimulantes del crecimiento para promover el crecimiento de células de hibridoma.
Tipos y métodos de preparación de ¿Células alimentadoras
(1)?Macrófagos peritoneales de ratón
(2)?Esplenocitos de ratón
(3)?Fibroblastos
3. ? Aislamiento de células del bazo
(1)? Matar a los ratones tirando de la columna cervical.
(2)?Extirpación quirúrgica aséptica del bazo
(3)?Limpieza y trituración
(4)?Recoge células
(5)?Lavado centrífugo
(6)?Conteo de células
4.? Fusión celular: mezcle células de mieloma y esplenocitos en una proporción de 1:10 o 1:5 y agregue el acelerador de fusión PEG.
Métodos de fusión celular: fusión PEG, virus Sendai y electrofusión.
5. ¿Cultura de selección de sombreros
? El principio del cultivo selectivo HAT: la vía principal correcta y la vía compensatoria para la biosíntesis del ADN celular. Cuando la presencia de A bloquea la vía principal de síntesis de ADN, se requiere compensación para sintetizar ADN. En este momento, se requiere HGPRT para sintetizar ADN a través de H, o se requiere TK para sintetizar ADN a través de t.
? Dado que las células de mieloma deficiente en HPRR o timidina hepática quinasa deficiente en TK se seleccionan como padres, la escuela solo se puede sintetizar a través de medios de cultivo de ADN de todas las condiciones, por lo que las células híbridas pueden obtener genes HGPPT o TK mediante complementación. Sólo las células híbridas pueden sobrevivir. Las células con deficiencia de enzimas no pueden sobrevivir en absoluto. Las células B monoclonales generalmente no pueden crecer durante mucho tiempo y desempeñar el papel de aislar las células híbridas.
? Crecimiento celular: 3-4 días después de la fusión, podemos ver las células de mieloma, que son clones mixtos y brillantes. Los sobrenadantes se cultivaron los días 7 a 9 después de la fusión y se detectaron anticuerpos específicos.
? Las células que sobrevivieron al examen fueron células de fusión de esplenocitos y células de mieloma.
6.? Cribado de clones positivos
Método de detección de células de hibridoma secretoras de anticuerpos monoclonales
Tecnología de inmunoenzimas: Introducción al ELISA
Tecnología de inmunofluorescencia: ensayo de inmunofluorescencia indirecta y citometría de flujo (negativos control: sobrenadante de cultivo de células de mieloma, control positivo: suero inmune de ratón)
7.? Cultivo clonal: clon único de células positivas
La clonación se refiere al proceso de reproducción y expansión de células individuales para formar una población de células con características uniformes.
Los métodos comunes incluyen: método de dilución limitante y tecnología de clonación en agar blando.
Método de dilución limitada: Recoger células de hibridoma de pocillos de secreción positivos.
Tecnología de clonación en agar blando: recolecte células de hibridoma de los pocillos de secreción positivos, agregue una concentración adecuada de células de hibridoma al medio de agar blando para formar una colonia celular con proliferación celular.
Identificación de anticuerpos monoclonales;
(1)? Prueba de sensibilidad de anticuerpos: Determinar el título de líquido ascítico y sobrenadante del cultivo.
(2)?Identificación de la especificidad del anticuerpo: si interactúa con otros antígenos.
(3) Determinación del título de anticuerpos
(4) Identificación de subclases de anticuerpos: IgG (IgG1, IgG2, IgG3), IgM.
(5)?Identificación de afinidad de anticuerpos
(6)?Análisis de reconocimiento de epítopos
8. método de inducción vivo, biorreactor.
Método de cultivo celular: cultivar células de hibridoma en una botella de cultivo o tanque de cultivo, recoger el sobrenadante y purificar el anticuerpo.
Método de inducción animal in vivo: a ratones Balb/c se les inyectó por vía intraperitoneal 0,5 ml de levonorfitano líquido, se inocularon células de hibridoma por vía intraperitoneal y se recogió la ascitis.
Biorreactor: Cultivo fermentador
Problemas comunes en el cultivo de anticuerpos monoclonales:
(1)? Contaminación: ambiente de cría, funcionamiento
( 2)? Las células de fusión no crecen: PEG, suero y medios HAT.
(3)? Secreción insuficiente de anticuerpos: contaminación por micoplasmas, mutación celular y problemas con el sistema de cultivo.
(4)? Difícil clonar células de hibridoma: calidad del suero, actividad celular
¿Parte 3? Tecnología de preparación de anticuerpos modificados genéticamente
Anticuerpos modificados genéticamente: una tecnología que transforma artificialmente células según los deseos individuales mediante medios de ingeniería genética.
Las ventajas incluyen principalmente: alta especificidad, calidad estable, bajo costo, proceso simple, heterogeneidad reducida, buena permeabilidad y funciones ricas.
1. Humanización de anticuerpos de ratón
Obstáculos en la aplicación de anticuerpos de ratón: inmunogenicidad, vida media corta e inactivación de fragmentos funcionales de anticuerpos.
1.? Anticuerpos quiméricos: clonación de genes de región variable, construcción de vectores de expresión y expresión de anticuerpos quiméricos.
2.? Anticuerpos modificados
2. Anticuerpos de molécula pequeña: anticuerpos Fab, anticuerpos Fv, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos monodominio y unidades mínimas de reconocimiento.
Ventajas de los anticuerpos de molécula pequeña:
(1) Pueden expresarse en sistemas procarióticos, reduciendo los costes de producción.
(2) Debido a su pequeño peso molecular y su gran capacidad de penetración, puede penetrar fácilmente en las lesiones y es beneficioso para el tratamiento de tumores y otras enfermedades.
(3) No contiene fragmentos Fc y no se une a los receptores Fc, lo que puede reducir los efectos adversos de los receptores Fc ampliamente distribuidos.
(4) La vida media en el organismo es corta, lo que resulta beneficioso para la eliminación de sustancias tóxicas en el organismo.
(5) Facilitar una mayor ingeniería genética.
Tres. ]Aplicaciones basadas en anticuerpos
1.? Inmunoterapia CAR-T:
? Inmunoterapia CAR-T: la inmunoterapia de células T con receptor de antígeno quimérico es un nuevo tipo de terapia celular adoptiva que utiliza las propias células inmunitarias del paciente para eliminar las células cancerosas en lugar de medicamentos.
? Tecnología CAR-T: una terapia que utiliza receptores de antígenos completamente quiméricos en células T genéticamente modificadas para resistir las células tumorales. Los receptores de antígenos quiméricos pueden reconocer específicamente antígenos relacionados con tumores o antígenos específicos de tumores. Después del reconocimiento y la unión, transmitirán señales de activación y proliferación a las células T, lo que hará que las células T se activen, proliferen y liberen citoquinas, matando así las células tumorales.
2. Punto de control inmunológico
3.? Antitoxina
4.? Núcleo de salida física
5.? Anticuerpos biespecíficos
Sección 4? [endif]Tecnología de biblioteca de anticuerpos
Tecnología de biblioteca de anticuerpos: clonar un conjunto completo de genes de regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpos mediante tecnología de clonación de genes, recombinarlos en vectores de expresión procarióticos y expresar directamente fragmentos de moléculas de anticuerpos funcionales a través del sistema procariótico, para detectar moléculas de anticuerpos específicas y genes de regiones variables.
1. Principio de la tecnología de presentación en fagos: La tecnología de presentación en fagos consiste en encontrar la proteína extraña o la secuencia de ADN en la posición apropiada en la cubierta del fago, de modo que el gen extraño pueda expresarse junto con la expresión del fago. proteína de cubierta y al mismo tiempo que el fago reensamblado, las proteínas extrañas también se pueden exhibir en la biotecnología de la superficie bacteriana. Hasta ahora, la gente ha dependido de sistemas de presentación de fagos filamentosos monocatenarios, sistemas de presentación de fagos T4, sistemas de presentación de fagos lambda, etc.
2.Procedimientos básicos para la preparación de anticuerpos en fagos
1.? Se recolectan linfocitos, se extrae el ARNm y se transcribe en ADNc o se extrae el ADN directamente del genoma de Spock.
2.? Genes de región variable de anticuerpos para amplificación de ADN
3. [Construcción de biblioteca de fagos recombinantes
4.? Detección de fagos recombinantes con propiedades deseadas
5.? La afinidad se madura mediante mutaciones o desplazamientos de hebras.
3. Características de la tecnología de anticuerpos fagos
1.? Los pasos de detección son simples, rápidos y efectivos.
2.? El proceso de selección se ha ampliado y se pueden analizar más de 1010 clones a la vez.
3.? El genotipo del anticuerpo está estrechamente relacionado con la expresión y el gen es estable y fácil de transformar.
4. Simular el proceso de maduración de afinidad del sistema inmunológico natural.
5.? No se requiere vacunación manual
6.? Puede reemplazar los anticuerpos policlonales animales.
7.? Ha sido un momento difícil para desarrollar la atención médica. La combinación aleatoria de genes de región variable de cadena ligera y cadena pesada in vitro puede generar combinaciones de cadena ligera y cadena pesada que existen en el cuerpo y obtener nuevos anticuerpos específicos.
8.? Se puede expresar en planes y sistemas, lo que facilita la producción a gran escala y tiene un bajo costo.
Cuarto, aplicación de la tecnología de biblioteca de anticuerpos
1.? Preparación de anticuerpos totalmente humanos
2.? Anticuerpos genéticamente modificados