¿Qué son los anticuerpos monoclonales? ¿Cuáles son sus características y valor de aplicación?
Los denominados anticuerpos monoclonales se refieren a anticuerpos homólogos producidos por células de hibridoma monoclonales que sólo reconocen epítopos específicos.
Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos especiales preparados artificialmente que tienen las propiedades de los anticuerpos generales. Es una globulina producida por células B que proliferan y se diferencian en células plasmáticas. Existe en los fluidos corporales y tiene funciones inmunes y media la inmunidad humoral. Puede unirse específicamente a los antígenos correspondientes (como patógenos) y ejercer efectos inmunológicos con la participación de otras moléculas y células inmunes.
La esencia de los anticuerpos monoclonales es la globulina, que tiene propiedades físicas y químicas, estructura espacial y actividad biológica. La globulina es relativamente sensible al calor y a los productos químicos. Calentar y agregar reactivos químicos puede destruir fácilmente su estructura, por lo que tiene una cierta vida media. Al igual que la globulina, tiene una región variable y una región constante. La región variable se une al antígeno para formar un complejo antígeno-anticuerpo. La región constante tiene un sitio de unión al complemento, que media la función del complemento, forma un complejo de ataque a la membrana y mata las células mutantes.
Los anticuerpos monoclonales tienen tanto las propiedades generales de los anticuerpos como sus especificidades. Es muy consistente en estructura y composición, y su especificidad y afinidad de unión al antígeno son exactamente las mismas. Es fácil de preparar y purificar en grandes cantidades in vitro y puede usarse ampliamente en los campos de la medicina y la microbiología. Los anticuerpos monoclonales fusionan células inmunes del bazo de ratón (células B) y células de mieloma inmortalizadas para formar células de hibridoma. Esta célula de hibridoma no sólo tiene la capacidad de reproducirse indefinidamente, sino que también tiene la capacidad de secretar anticuerpos, por lo que es in vitro.
La preparación de anticuerpos monoclonales es compleja e implica diversas biotecnologías. El proceso se describe brevemente aquí. Los animales de línea pura (como los ratones Bala-C) se inmunizan con antígenos específicos y se inyectan repetidamente por vía subcutánea en múltiples puntos de la espalda. Cada inyección debe ser cuantitativa. Preste atención al intervalo de tiempo entre inoculaciones y agregue apropiadamente el adyuvante de Freund. Después de criarlos durante un período de tiempo, los animales vacunados con anticuerpos séricos elevados se sacrificaron en condiciones estériles y se extrajeron y separaron los bazos. Centrifugar las células suspendidas y colocarlas en una placa de cultivo para su uso posterior. Se colocan células de mieloma de ratones de pura raza en una placa de cultivo y se añaden algunas células alimentadoras (como timocitos y macrófagos) para promover su crecimiento. Hay muchos tipos de células en la solución mixta. Para extraer células diana (células de hibridoma), se debe realizar una selección HAT para obtener células de hibridoma puras. Entre muchas células de hibridoma, algunas no expresan inmunoglobulinas, mientras que otras expresan otros tipos de globulinas. Por lo tanto, se deben utilizar métodos de detección específicos para seleccionar células de hibridoma positivas entre numerosas células. Las células diana deben aislarse en células individuales y clonarse en líneas celulares y luego transferirse a otros medios para el cultivo de expansión. Para obtener grandes cantidades de anticuerpos, los ratones deben ser inoculados por vía intraperitoneal y luego los anticuerpos se aíslan y purifican del líquido ascítico.
Aislamiento, purificación y detección de anticuerpos monoclonales. Poner el medio de cultivo amplificado in vitro o la ascitis inyectada en la cavidad abdominal de ratones en un tubo de centrífuga y centrifugar a alta velocidad, tomar el sobrenadante y ponerlo en un portaobjetos de vidrio, agregar el antígeno correspondiente para ver si hay coagulación.
Después de la llegada de los anticuerpos monoclonales, se han logrado logros brillantes, como el uso de anticuerpos monoclonales anti-exotoxina difteria para tratar Corynebacterium diphtheria; los anticuerpos monoclonales anti-lipopolisacárido A se usan para tratar la septicemia bacteriana G~; . La tecnología monoclonal ganó el Premio Nobel de Medicina 65438-0984. Su función principal es utilizar anticuerpos monoclonales en lugar de anticuerpos policlonales para superar las reacciones cruzadas y mejorar la especificidad y sensibilidad de los experimentos inmunológicos, promoviendo así el desarrollo de la ciencia del laboratorio médico utilizando anticuerpos monoclonales como columnas de afinidad, puede separar y purificar con extrema eficacia; bajo contenido Antígenos solubles, como hormonas, citocinas, antígenos tumorales y otros antígenos difíciles de purificar. Esto abre una nueva vía para la purificación de materiales: los anticuerpos monoclonales preparados reconocen receptores específicos en la superficie celular, si se les combinan medicamentos antitumorales (como toxinas o sustancias radiactivas) para construir misiles biológicos, se espera que conquisten al ser humano. enfermedades - tumores .
Los anticuerpos monoclonales tienen amplias perspectivas de desarrollo, pero también tienen sus limitaciones. Como antígeno exógeno, los anticuerpos monoclonales pueden inducir respuestas inmunitarias después de inyecciones repetidas, producir los anticuerpos correspondientes y provocar reacciones de rechazo.
Por tanto, el uso clínico de anticuerpos monoclonales es riesgoso y puede utilizarse con precaución en situaciones de prevención de emergencia.
En resumen, los anticuerpos monoclonales han supuesto grandes avances para los seres humanos en la detección y el tratamiento de enfermedades, aunque todavía presentan algunas deficiencias. ¡Creo que en un futuro próximo los humanos prepararemos más anticuerpos monoclonales excelentes y contribuiremos más a la lucha contra los tumores!
Los anticuerpos monoclonales tienen las características de propiedades físicas y químicas altamente consistentes, actividad biológica única, fuerte especificidad de unión a antígenos, fácil operación manual y control de calidad, y fuentes fáciles. Estas ventajas hacen que sea muy valorado nada más salir al mercado y ampliamente utilizado en investigaciones biológicas y médicas.
1Como ligando de cromatografía de afinidad
Los anticuerpos monoclonales pueden unirse específicamente a sus antígenos correspondientes, por lo que pueden identificar componentes individuales de sistemas complejos. Siempre que se obtenga un anticuerpo monoclonal contra un determinado componente, se puede inmovilizar en una columna de cromatografía como ligando, y este componente específico se puede separar y purificar de la mezcla compleja mediante cromatografía de afinidad. Si se utiliza una columna de cromatografía de afinidad antigonadotropina coriónica humana (hCG), se puede extraer hCG pura de la orina de mujeres embarazadas. Comparado con otros métodos de extracción (precipitación, cromatografía hidrófoba de alta resolución, etc.). ), que tiene las ventajas de simplicidad, velocidad, economía y alta actividad del producto.
Como arma orientadora del tratamiento biológico.
Los liposomas son microcápsulas bicapa continuas compuestas por fosfolípidos anfifílicos hidrofílicos y lipófilos que contienen un espacio de fase acuosa y pueden encapsular sustancias solubles en agua. Los liposomas que encapsulan fármacos citotóxicos se conjugan con anticuerpos y pueden dirigirse para atacar células diana, llamadas inmunoliposomas. Esta "terapia guiada" ha logrado resultados satisfactorios tanto en experimentos con animales como en experimentos in vitro. Por ejemplo, los inmunoliposomas termosensibles son anticuerpos contra células de cáncer de mama humano modificados con ácidos grasos de cadena larga hidrófobos. Los anticuerpos tienen largas cadenas de carbono hidrófobas y todavía están insertados parcialmente en la membrana de bicapa lipídica de los liposomas. expuestos en la superficie de la membrana, manteniendo así la actividad del anticuerpo. Los inmunoliposomas termosensibles pueden reconocer específicamente las células diana (células de cáncer de mama humano) y romper los liposomas a través del cambio de fase de temperatura, liberando así direccionalmente los fármacos. Además, los agentes citotóxicos como los fármacos quimioterapéuticos, las toxinas bacterianas, las toxinas vegetales o los isótopos radiactivos pueden entrecruzarse directamente con anticuerpos monoclonales contra los antígenos tumorales, y los agentes citotóxicos pueden localizarse en las células tumorales y utilizar su efecto guía para matar directamente el tumor. células. Esto no sólo mejora la eficacia del anticuerpo, sino que también reduce la respuesta tóxica del agente citotóxico a las células normales. Si se utilizan anticuerpos monoclonales anti-células T en combinación con daunorrubicina, no tienen ningún efecto letal sobre los linfocitos no T in vitro. Sin embargo, todavía existen muchas dificultades técnicas para aplicar este método a aplicaciones clínicas, incluido el rechazo del cuerpo humano a los anticuerpos monoclonales murinos.
3 Como inmunosupresor
Como nuevo tipo de inmunosupresor, los anticuerpos monoclonales anti-linfocitos T humanos se han utilizado ampliamente en el tratamiento clínico de enfermedades autoinmunes y en el tratamiento del rechazo de trasplantes de órganos. Su mecanismo de acción depende del tipo de anticuerpo monoclonal y de sus propiedades inmunológicas. La inyección de anticuerpos monoclonales contra el antígeno Thy-1 de ratón inhibe el rechazo de injertos de piel en ratones. Además, la médula ósea de un donante para el trasplante alogénico de médula ósea se puede tratar ex vivo con anticuerpos monoclonales anti-células T y complemento, lo que puede reducir la aparición de la enfermedad de injerto contra huésped.
4 Como sonda en trabajos de investigación
Los anticuerpos monoclonales solo se unen a un determinado epítopo (es decir, determinante antigénico) en la molécula del antígeno, por lo que se pueden utilizar como sonda en investigación. trabajo. En este momento, se puede estudiar la relación entre la estructura y función del antígeno en diferentes niveles de moléculas, células y órganos, y se puede dilucidar teóricamente su mecanismo de acción. Si se utiliza como sonda un anticuerpo monoclonal marcado con una sustancia fluorescente, se determinará la posición y distribución de las correspondientes macromoléculas biológicas (proteínas, ácidos nucleicos, enzimas, etc.). ) se puede determinar fácilmente en las células.
5. Mejorar la inmunogenicidad de los antígenos
Los anticuerpos tienen una larga historia de mejorar la inmunogenicidad de los antígenos. En la década de 1960, se descubrió que los lechones tenían dificultades para producir anticuerpos contra el toxoide tetánico. La inyección del correspondiente anticuerpo específico IgG puede mejorar eficazmente la respuesta inmune al virus de la encefalitis equina venezolana. Desde 1984, Celis et al. han descubierto que la IgG anti-HBs puede potenciar la proliferación de clones de células T humanas específicas estimuladas por el antígeno HBs e inducir interferón. Se descubrió en ratones que cuando dosis bajas de antígeno HBs no producían una respuesta inmune, agregar un complejo compuesto de anticuerpos anti-HBs podía inducir efectivamente una respuesta inmune. Sobre la base de esta función, se desarrollaron vacunas terapéuticas de complejos antígeno-anticuerpo de la hepatitis B.
6 Como reactivo de prueba médica
Como reactivo de prueba médica, los anticuerpos monoclonales pueden aprovechar al máximo sus ventajas. Los anticuerpos monoclonales tienen una fuerte especificidad, lo que mejora en gran medida la especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo, reduce la posibilidad de reacción cruzada con otras sustancias y hace que los resultados de la prueba sean más confiables. La homogeneidad y singularidad de la actividad biológica de los anticuerpos monoclonales hacen que los resultados de la región antígeno-anticuerpo sean fáciles de controlar y estandarizar. En la actualidad, muchos kits de detección están hechos de anticuerpos monoclonales y sus usos principales son los siguientes:
(1) Diagnóstico de diversos patógenos
Este es el anticuerpo monoclonal más utilizado en En el campo, hay una gran cantidad de reactivos de diagnóstico para elegir. Por ejemplo, reactivos utilizados para diagnosticar el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C, el virus del herpes, el citomegalovirus, el virus de Epstein-Barr y diversas infecciones microbianas y parasitarias. Debido a su alta sensibilidad y especificidad, los anticuerpos monoclonales tienen ventajas únicas para identificar cepas y subtipos, variantes de virus y antigenicidad de parásitos con diferentes ciclos de vida.
(2) Detección de antígenos específicos de tumores y antígenos asociados a tumores
Utilizado para el diagnóstico, clasificación y localización de tumores. Aunque aún no se han preparado anticuerpos monoclonales contra antígenos específicos de tumores, durante mucho tiempo se han utilizado en ensayos clínicos anticuerpos monoclonales contra antígenos asociados a tumores (como la alfafetoproteína, la proteína básica tumoral y el antígeno carcinoembrionario).
Con la aplicación de la tecnología de hibridoma de linfocitos, se han establecido muchas líneas celulares de hibridoma con marcadores tumorales antihumanos para proporcionar un diagnóstico temprano de tumores, dilucidar la aparición y el desarrollo de tumores y comprender la actividad biológica del tumor. células y sentó las bases para la investigación cuantitativa. El examen de muestras de patología con anticuerpos monoclonales antitumorales puede ayudar a determinar el sitio primario de los tumores metastásicos. Los anticuerpos monoclonales marcados con radionúclidos se pueden utilizar para el diagnóstico in vivo y, combinados con la tomografía de rayos X, pueden diagnosticar cuantitativamente el tamaño del tumor y la metástasis.
(3) Detección de marcadores de superficie de linfocitos
Se utiliza para distinguir subpoblaciones celulares y etapas de diferenciación celular. Por ejemplo, la detección de marcadores de la serie CD puede ayudar a comprender la diferenciación celular y los cambios cuantitativos y cualitativos en las subpoblaciones de células T, y tiene importancia de referencia para el diagnóstico de diversas enfermedades. La detección de antígenos de la superficie celular guiará la estadificación de la enfermedad, el efecto del tratamiento y el pronóstico de los pacientes con leucemia. La detección del antígeno de histocompatibilidad es una parte importante de la inmunología de los trasplantes y el uso de anticuerpos monoclonales para detectar sus sitios puede obtener resultados más confiables.
(4) Determinación de componentes traza en el cuerpo humano
Utilizando anticuerpos monoclonales combinados con otras tecnologías, se puede medir una variedad de componentes traza en el cuerpo humano. Por ejemplo, el radioinmunoensayo es un método establecido utilizando la sensibilidad del isótopo y la especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo. Puede medir entre 10-9 y 10-12 g, lo que permite el análisis cuantitativo de hormonas que originalmente eran difíciles de medir. Además de las hormonas, también se pueden detectar muchas enzimas, vitaminas, fármacos y otras sustancias bioquímicas. Esto tiene importancia práctica para juzgar el estado de salud del sujeto, detectar enfermedades, guiar el diagnóstico y el tratamiento clínico.
En resumen, la aplicación de anticuerpos monoclonales en teoría y práctica se ha convertido en un medio importante para resolver muchos problemas importantes en biología y medicina. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales utilizados anteriormente son de origen murino y pueden provocar alergias a proteínas extrañas cuando se utilizan para la prevención y el tratamiento de enfermedades humanas, lo que limita en gran medida su valor de aplicación clínica. Además, la vida media de los anticuerpos derivados de ratón en el cuerpo humano se acorta y se reduce la actividad biológica. Por ello, la gente se ha comprometido con la investigación de anticuerpos humanos, como la hibridación de células del bazo humano con células de mieloma de ratón; la transformación de linfocitos B humanos con el virus de Epstein-Barr y la preparación de anticuerpos quiméricos mediante ingeniería genética; Pero todos encontraron dificultades considerables. Los métodos más recientes de los últimos años son extraer y amplificar el ADN que codifica anticuerpos humanos, construir plásmidos, establecer una biblioteca combinatoria de anticuerpos y luego utilizar la biblioteca del donante para establecer una subbiblioteca para un antígeno específico. Los fragmentos de anticuerpos (Fab) preparados mediante esta tecnología son anticuerpos humanos, que tienen las características de construcción de biblioteca simple y expresión estable de anticuerpos. Hasta ahora se han producido diversos anticuerpos. Es previsible que esta tecnología tenga buenas perspectivas de desarrollo y aplicación.
Una revisión de los anticuerpos monoclonales
1. Definición de anticuerpos y anticuerpos monoclonales de primera generación (producidos por células de hibridoma)
Los anticuerpos son producidos por los linfocitos B. Glicoproteína producida en una respuesta inmune a la estimulación antigénica. Es un tipo de globulina que puede unirse específicamente al antígeno correspondiente y producir diversos efectos inmunológicos (efectos fisiológicos). La Organización Internacional de la Salud denomina inmunoglobulinas a una clase de proteínas con actividad de anticuerpos y una estructura química similar a las inmunoglobulinas, que se refiere a proteínas del mismo tipo que los anticuerpos.
Entre 70.000 y 70.000, se denomina "cadena pesada" (cadena H). La cadena ligera, la cadena pesada y la doble cadena están conectadas por enlaces disulfuro, y esta estructura de cuatro cadenas (L2H2) constituye una molécula de inmunoglobulina. Tiene 550 residuos de aminoácidos con un peso molecular relativo de 55.000. La estructura básica del anticuerpo es la que se muestra en la figura y consta de cuatro cadenas peptídicas, de las cuales dos cadenas peptídicas con un peso molecular relativamente bajo contienen aproximadamente 210 residuos de aminoácidos; , y el peso molecular relativo es de aproximadamente 24.000. Se denomina "cadena ligera" (cadena L); las otras dos cadenas peptídicas relativamente grandes contienen aproximadamente 450 y sus anticuerpos correspondientes se denominan IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, respectivamente. . La clasificación serológica de los anticuerpos se basa en las diferencias antigénicas de las cadenas pesadas: los animales se inmunizan con varias cadenas pesadas aisladas y purificadas para obtener los antisueros correspondientes, y luego las similitudes y diferencias estructurales se analizan mediante métodos de detección serológica como la reacción cruzada inmune. Después de repetidas comprobaciones, finalmente se descubrió que los humanos tenemos cinco tipos diferentes de cadenas pesadas, que (1) se unen a varias células y (5) pueden causar daño inmunológico. La IgG representa más del 75% de los anticuerpos totales en el suero adulto y es el principal anticuerpo en el suero humano. Es producido por las células B y su estructura funcional también es la más claramente estudiada. Sus principales funciones fisiológicas son: (1) Neutralizar toxinas y virus, (2) Aglutinación y precipitación de antígenos, (3) Activación del complemento, (4) Utilización del receptor de membrana específico (Fc). La tecnología de anticuerpos monoclonales es pionera en el campo. de las ciencias biológicas modernas. Los anticuerpos monoclonales tienen un amplio valor de aplicación y han abierto nuevas vías para la investigación en biología, medicina y otras ciencias naturales.
Anticuerpos monoclonales de segunda generación: anticuerpos monoclonales quiméricos o humanizados tras recombinación genética.
Anticuerpo quimérico: se refiere a reemplazar la región constante de ratón con la región constante humana y retener la secuencia de la región variable del anticuerpo monoclonal de ratón para formar un anticuerpo híbrido humano-ratón. Su proceso de desarrollo es rápido y puede reducir en gran medida la inmunogenicidad de los anticuerpos heterólogos, pero conserva casi toda la especificidad y afinidad del anticuerpo monoclonal de ratón original. Además, también tiene las funciones de los anticuerpos humanos, como la fijación del complemento, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), etc. Ejemplos de anticuerpos quiméricos exitosos incluyen: Rituximab: anticuerpo murino anti-CD20 de IDEC Pharmaceuticals/Genentech que contiene la región constante de IgG1κ humana para el tratamiento del linfoma B. Su efecto antilinfoma puede provenir principalmente de la acción del complemento, la ADCC y la inducción de la apoptosis de las células tumorales.
remi cade: anticuerpo anti-TNF-α de cento cor, utilizado para tratar la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn.
Mimético: Anticuerpo anti-CD25 de Novartis, utilizado para combatir el rechazo de trasplantes.
Erbitux: El anticuerpo monoclonal anti-EGFR (Her-1) de la empresa estadounidense Imclone ha sido aprobado por la FDA para el tratamiento del cáncer colorrectal.
Anticuerpos humanizados: utilizando numerosos anticuerpos de ratón existentes que han sido analizados en detalle, se injertan fragmentos de anticuerpos (CDR) que están en contacto directo con el antígeno en una estructura de anticuerpo humano. Después de la modificación de la afinidad, puede mantener su especificidad y la mayor parte de su afinidad, al tiempo que casi elimina su inmunogenicidad y sus efectos secundarios.
Ejemplos de éxito:
Herceptin: un anticuerpo anti-HER2/neu de Genentech para el tratamiento del cáncer de mama.
syns GIS: Anticuerpo anti-F de Medimmune, utilizado para tratar infecciones virales respiratorias.
Zenapax: Anticuerpo anti-CD25 de Protein Design Laboratories (PDL)/Roche para combatir el rechazo de trasplantes.
H-R3: Anticuerpo monoclonal anti-EGFR (Her-1) del Centro Cubano de Inmunología Molecular, utilizado para tratar el cáncer de cabeza y cuello.
3. Anticuerpos de presentación en fagos y anticuerpos totalmente humanos
Preparación de anticuerpos humanos mediante (1) tecnología de presentación en fagos
Basado en la expresión de fragmentos de anticuerpos en el membrana externa del fago Capacidad para construir una serie de bibliotecas de anticuerpos y luego seleccionar los fragmentos de anticuerpos correspondientes y los antígenos diana en la biblioteca, y luego, mediante el procesamiento in vitro, se pueden formar anticuerpos humanos funcionales completos. Este método se puede utilizar para preparar anticuerpos monoclonales contra antígenos simples o complejos y obtener anticuerpos con afinidad moderada, pero este método requiere una detección de alto rendimiento. Existen algunos estudios clínicos de fase II/III, como el D2E7 y el CAT-152 de Cambridge Antibody Technology (CAT), para el tratamiento de la artritis reumatoide y el glaucoma, respectivamente. D2E7 es un anticuerpo monoclonal anti-TNF-α desarrollado por Abbott Laboratories.
A juzgar por los datos clínicos de fase III proporcionados en junio de 2002, se espera que entre en el mercado en un futuro próximo.
(2) Se utilizan animales transgénicos para preparar anticuerpos humanos.
Derivados de anticuerpos: Varios investigadores están desarrollando derivados de anticuerpos monoclonales que son más fáciles de producir y utilizar, el más exitoso de los cuales es Mark Green de la Universidad de Pensilvania. Estaba buscando pequeñas moléculas peptídicas derivadas de la CDR de la región determinante de la complementariedad del anticuerpo [16] y fundó CDR Therapeutics (ahora parte de Xcyte Therapeutics) para acelerar la comercialización de su producción de péptidos. Su péptido tiene la afinidad y selectividad del anticuerpo monoclonal original, pero como molécula pequeña, debería ser no inmunogénico y más fácil de preparar.