Preguntas sobre las células T y las células tumorales
Estos compuestos, llamados anticuerpos policlonales, a menudo producen reacciones cruzadas no específicas en los tratamientos médicos, lo que conduce a resultados falsos positivos. Según la teoría de la "selección clonal" de Burnett, cada clon de células linfoides B sólo puede producir un tipo de anticuerpo que reconoce un determinante antigénico específico, es decir, un anticuerpo monoclonal (McAb).
Los anticuerpos monoclonales se producen fusionando células productoras de anticuerpos con células de mieloma con capacidad de proliferación ilimitada y utilizando dilución limitante y clonación para convertir las células de hibridoma en excelentes líneas celulares monoclonales puras.
Para preparar anticuerpos monoclonales contra un antígeno específico, primero se debe preparar un antígeno adecuado para la inmunización, y luego utilizarlo para inmunizar a los animales.
Algunos antígenos se pueden sintetizar químicamente: la digoxina.
La mayoría de los antígenos son mezclas que deben ser inmunizadas, cribadas y clonadas.
En 1975, Kohler y Milstein de la Universidad de Cambridge en el Reino Unido utilizaron tecnología de fusión celular para fusionar con éxito células de bazo de ratón con células de mieloma de ratón para formar células de hibridoma, y aprovecharon la capacidad de proliferación ilimitada del mieloma. células Producción dirigida de anticuerpos monoclonales que actúan solo sobre un determinado determinante antigénico. Esta es la famosa tecnología de hibridoma, que se considera una revolución en inmunología.
Inmune a los ratones y estimula la producción de anticuerpos.
Aislamiento de células productoras de anticuerpos del bazo
Células de mieloma en cultivo de tejidos
Las células productoras de anticuerpos se fusionan con células tumorales cultivadas para formar células de hibridoma.
Cribado de células de hibridoma y aislamiento de anticuerpos monoclonales a partir de células de hibridoma productoras de anticuerpos
Sección 2 Anticuerpos monoclonales y su preparación
Animales Antígenos en la inmunización ①.
Inmunizar animales (ratones) con antígenos o inmunógenos, obtener linfocitos B estimulados por antígenos e hibridar con células de mieloma es el primer paso para preparar anticuerpos monoclonales. Actualmente, la mayoría de las líneas celulares de mieloma cultivadas provienen de ratones o ratas, y los animales seleccionados para la inmunización también deben ser animales similares a ratones o ratas para superar la inestabilidad de las células de hibridoma.
Sección 2 Anticuerpos monoclonales y su preparación
1. Antígenos en la inmunización animal ②
Seleccionar ratas hembra de 18-20 semanas mediante inmunización in vivo Rata ; elija un inmunógeno con una gran cantidad de antígeno y una fuerte inmunogenicidad.
① Se inyectan antígenos particulados (bacterias, células) de 107 células en el abdomen de los ratones; se administran inmunizaciones adicionales 1-2 veces a intervalos de 1-3 semanas. ②¿Antígeno soluble 10-100? G/animal, inyectado con adyuvante completo de Garfield*, con un intervalo de 2 a 4 semanas, y suplementado con antígeno sin adyuvante 1 a 2 veces. ③Inyecte el antígeno por vía intravenosa por última vez antes de recolectar las células.
* Adyuvante completo de Freund: células de Mycobacterium tuberculosis o "BCG" humanas muertas y secas se suspenden en aceite emulsionado. Después de mezclarlo con el antígeno e inyectarlo debajo de la piel de los animales, el antígeno se liberará lenta y uniformemente, induciendo al sistema inmunológico del animal a producir anticuerpos de manera eficiente y uniforme.
Sección 2: Anticuerpos monoclonales y su preparación
1. Antígenos en la inmunidad animal ③
Cuando no se cumplen las condiciones para la inmunidad in vivo o el antígeno está relativamente inmunogénico Cuando es débil, se utiliza la inmunización in vitro.
① Tome el bazo de un ratón de 4 a 8 semanas y use una malla de acero inoxidable de malla 200 para hacer una suspensión celular.
② Agregue antígeno para controlar el antígeno; concentración en la suspensión celular ¿A 0,55,0? g/ml; ③Cultivo a 37°C y 5% de CO2 durante 4 a 5 días para aislar los esplenocitos.
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2. Selección de fusión celular en hibridomas ①
Fusión celular
Células del Bazo (1) ×108)
Polietilenglicol
40-50%, Mr=4000
Células de mieloma (2-3×107)
Para mejorar la velocidad de fusión, se puede agregar dimetilsulfóxido (DMSO) a la solución de PEG.
Diluir lentamente la fusión con tampón durante 2 minutos.
Nota: PEG y DMSO son tóxicos para las células, y su tiempo de contacto con las células debe controlarse estrictamente. Antes de la fusión, las células mezcladas se pueden centrifugar a baja velocidad durante 5 minutos para que las células entren en estrecho contacto primero.
Sección 2: Anticuerpos monoclonales y su preparación
II. Selección de células de hibridoma de fusión ②
Cribado de células de hibridoma
Después de la fusión Para el tratamiento, se pueden producir cinco tipos de células en la solución mixta: células de fusión de bazo-bazo, tumor-tumor, células de fusión de bazo-tumor y células de no fusión de bazo-tumor.
Se debe utilizar la selección HAT para descartar células de fusión de tumor de bazo (células de hibridoma).
¿Qué es la “selección de sombrero”?
Principios básicos del cribado de hibridomas
Los genes del cultivo HAT reciben el nombre de tres compuestos: hipoxantina aminopterina timidina hipoxantina: H aminopterina: A timidina: t.
H
HGPRT
Utilice medio HAT para excluir células de dos genotipos: ① hgprt -: carece de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa Células que no pueden crecer (células de mieloma) ② tk -: las células que carecen de timidina quinasa no pueden crecer (ningún tipo de célula carece de esta enzima y no hay efecto de selección). Detección HAT de fusiones de células de mieloma de ratón con esplenocitos de ratón.
Molécula precursora
dGTP
A
Durante la fusión celular se producen cinco tipos de células:
Desoxitimidina trifosfato
T
Tank
Células de mieloma: hgprt -, incapaces de crecer; esplenocitos: HAT no puede crecer in vitro Células de fusión bazo-bazo: no pueden; crecer en cultivo HAT in vitro;
La ruta de síntesis de desoxinucleótidos necesarios para la síntesis de ADN intracelular y el principio de selección HAT
Enzima de transferencia de ribosa fosfato de hipoxantina-guanina
Células de fusión tumor-tumor: hgprt -, incapaces de crecer;
Células de fusión tumoral de bazo: las células del bazo pueden crecer porque son Hg prt++;
Glucósido quinasa de tórax (timidina quinasa)
Sección 2 Anticuerpos monoclonales y su preparación
2. Selección de la fusión de células de hibridoma ③
Mezclar las células fusionadas se suspendieron en medio HAT (células alimentadoras adicionales - macrófagos peritoneales de ratón, esplenocitos o timocitos, las citoquinas liberadas por estas células son beneficiosas para la proliferación de células de hibridoma), a 96 Cultivo en placa de pocillos durante 6 días (reemplace el medio cada 2 a 3 días 1/2-2/3 );
Utilice medio HT (día HAT sin aminopterina;
Luego continúe cultivando con medio completo RPMI1640.
*Del octavo al noveno día después de la fusión, el sobrenadante del cultivo se puede analizar en busca de anticuerpos para detectar gradualmente clones positivos >Sección 2 Anticuerpos monoclonales y su preparación
3 Detección y clonación de clones positivos ①
Detección: solo 5. % de los esplenocitos animales se pueden producir después de la inmunización.
Solo después de que estas células se fusionen con las células de mieloma se pueden producir células de hibridoma.
En los días 8-9 después de la fusión, se pueden producir células de hibridoma. que pueden producir anticuerpos deben seleccionarse, generalmente utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (P148 Figura 4-3)
Sección 2 Anticuerpos monoclonales y su preparación
En tercer lugar, seleccione los clones positivos. y clonar ②
Clonación: clonar células positivas lo antes posible es útil para superar la inestabilidad de las células de hibridoma.
Método de dilución limitada: diluir la suspensión del clon positivo en solo 1 célula. en cada pocillo de cultivo;
p>
Método de agar blando: use agarosa al 5% para hacer que el medio de cultivo sea semisólido y los descendientes clonados de una célula formarán grupos de células. El proceso debe repetirse al menos tres veces para garantizar que se puedan obtener clones 100% positivos.
Después de estos pasos, cada clon obtenido es un clon unicelular.
Sección 2: Monoclonal. anticuerpos y su preparación
Anticuerpos de células de hibridoma. Identificación de morfología ① Identificación citológica
Cariotipo cromosómico
Imágenes microscópicas y análisis de cariotipo de cromosomas humanos en metafase
(Frotis cromosómico de cultivo de leucocitos de sangre periférica)
Sección 2 Anticuerpos monoclonales y su preparación
Identificación de la morfología de los anticuerpos de células de hibridoma ① ¿Identificación citológica? La tecnología de preparación de cromosomas animales es relativamente simple y el cariotipo cromosómico se puede determinar con un microscopio óptico común.
? Los cromosomas de los ratones son todos cromosomas telecéntricos, 2n = 40. El número de cromosomas en las células de mieloma es superior a 40, 2n > 40, y existen cromosomas marcadores exclusivos de la osteomielitis. Por lo tanto, el número de cromosomas de una célula de hibridoma debe ser la suma de los números de cromosomas de las dos células.
Debido a que se prefiere HAT, solo existe una condición para determinar las células de hibridoma mediante análisis de cariotipo: 2n≥80.
Sección 2: Anticuerpos monoclonales y su preparación
IV. Identificación de la morfología de los anticuerpos de las células de hibridoma ② Identificación de las características de los anticuerpos
Los linfocitos en el bazo del ratón son policlonales y cada anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma es un anticuerpo monoclonal inducido por un determinante antigénico. Es necesario determinar las propiedades inmunológicas de los anticuerpos producidos por estas células linfoides B monoclonales.
La identificación de las características biológicas de los anticuerpos secretados por células de hibridoma debe realizarse según los requisitos para la preparación de anticuerpos monoclonales.
Sección 2 Anticuerpos monoclonales y su preparación
Verbo (abreviatura de verbo) Preparación a gran escala de anticuerpos monoclonales ①Método de inducción animal: seleccione los animales progenitores del hibridoma e inyecte por vía intraperitoneal 0,5 ml del disolvente orgánico se redujo a fitano, se inyectaron 1 x 106 células de hibridoma 0-2 semanas después y se extrajeron varias veces después de 7-12 días.
Este método generalmente puede obtener 5-20 mg/ml de anticuerpos, y la operación es simple y económica. Sin embargo, existen muchos tipos de proteínas impurezas en el líquido ascítico, lo que dificulta la purificación.
Sección 2 Anticuerpos monoclonales y su preparación
Verbo (abreviatura de verbo) Preparación a gran escala de anticuerpos monoclonales ②
Métodos de cultivo in vitro:
Utilice medio RPMI1640 y agregue entre un 10 y un 20 % de suero fetal bovino o de ternera (BSA) para cultivar directamente células de hibridoma in vitro. ¿El rendimiento de anticuerpos llega a 5-20? g/ml; si se utiliza una mezcla de albúmina, insulina, transferrina y etanolamina en lugar de suero de ternera, se puede reducir la infección por micoplasma, pero el rendimiento no es alto.
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Verbo (abreviatura de verbo) Preparación a gran escala de anticuerpos monoclonales ③
Tecnología de cultivo en suspensión continua Método de cultivo en suspensión de microportadores , agregando partículas sólidas de DEAESephadex A50 (dietilaminoetil-dextrano) al medio de cultivo para "anclar" las células del hibridoma, lo que es beneficioso para su crecimiento vigoroso;
La densidad celular puede alcanzar 107-108/ml, puede ¿Se aumentará la producción de anticuerpos a 400-4000? μg/ml.
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Purificación de anticuerpos monoclonales intransitivos ①
Preparación monoclonal por inducción animal Purificación de anticuerpos
(1) Tratamiento de clarificación y precipitación:
Centrifugar a 1.000×g durante 5 minutos, luego tomar el sobrenadante para eliminar glóbulos rojos, restos celulares, coágulos de fibrina y lípidos. Centrifugar a 20.000×g; durante 30 min, tomar el sobrenadante para eliminar las pequeñas partículas residuales; utilizar 0,2? m Filtración por membrana microporosa: elimina bacterias contaminantes, micoplasmas y lípidos. Más del 90 % de los anticuerpos monoclonales se pueden recuperar mediante precipitación con (HN4)2SO4 saturado al 50 %.
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Purificación de anticuerpos monoclonales verbos intransitivos ②
⑵Separación: filtración en gel, análisis de capas de intercambio aniónico y cromatografía de inmunoafinidad.
① Filtración en gel: separación en columna Sephadex G200, el pico más alto es el anticuerpo monoclonal IgM y los otros dos picos son IgG.
La muestra se transfiere automáticamente a un vial y luego se extrae en un bucle cuantitativo para su análisis en una columna GPC. La fracción de alto peso molecular se descarga en una botella de desechos y otros analitos se recogen en botellas de muestras para su posterior análisis (o evaporación en línea).
Sistema de filtración en gel AS-2000
Sección 2 Anticuerpos monoclonales y su preparación
Purificación de anticuerpos monoclonales de verbos intransitivos ③
②Intercambio aniónico cromatografía:? Sobrenadante de hibridoma: ¿clarificar el sedimento (ajustar el pH a 5,5)? Después de pasar por la columna EDAE-G (dietilaminoetilcelulosa), todos los anticuerpos se unen a la columna y se eliminan el 55% de las proteínas extrañas.
Eluir anticuerpos monoclonales con diferentes subunidades utilizando eluyentes con diferentes valores de pH y diferentes fuerzas iónicas. ? Un nuevo intercambiador de iones con alta capacidad, alto caudal y estabilidad química es adecuado para la purificación a gran escala de anticuerpos monoclonales.
Sección 2: Anticuerpos monoclonales y su preparación
Purificación de anticuerpos monoclonales ④ ③Cromatografía de inmunoafinidad: ¿utilizar proteína A inmovilizada (aislado de Staphylococcus aureus)? 1 ml de columna de Proteína A-Sefarosa Cl-4B; Tampón de equilibrio: Gly-NaOH 1,5 mol/L (pH 8,9), que contiene 3 ml/L de NaCl;;? Tampón de elución: 0,1 mol/L de ácido cítrico (ajustado a diferentes valores de pH) pH 6,0/IgG 1 pH 4,5/IgG 2A pH 4,0/IgG 3 pH 3,5/IgG 2B pH 3,0 lavado.