¿Qué es genéticamente modificado?
A finales de los años 1970 y principios de los 1980, se utilizaron plásmidos Ri y Ti de tipo salvaje para transformar células de tabaco y patata para obtener plantas regeneradas, y luego se establecieron plantas utilizando plásmidos Ti como vectores. Tecnología de transformación genética. En los últimos años, la tecnología de transformación genética de plantas se ha desarrollado rápidamente y se han establecido muchos sistemas de transformación. Según el método de introducción de genes en células vegetales receptoras, la tecnología de transformación genética vegetal se puede dividir aproximadamente en dos categorías: transferencia de genes mediada por vectores y transferencia directa de genes o ADN. La llamada transferencia de genes mediada por vectores es una tecnología que conecta el gen objetivo con un ADN vectorial y luego transfiere el gen extraño a las células vegetales mediante infección del huésped y otros medios. La transferencia directa de ADN se refiere a una tecnología que utiliza las características biológicas de las células vegetales para transferir genes extraños a las células vegetales mediante métodos físicos, químicos y biológicos.
(1) La transformación de vectores mediada por Agrobacterium es el método de transformación de vectores más importante. El plásmido Agrobacterium Ti modificado se puede utilizar como vector para transferir eficazmente genes extraños. Existen dos métodos básicos para obtener plantas transformadas: uno es el método de cultivo * * * de 1979 Marton et al. El protoplasma vegetal se utiliza como receptor; uno es el cocultivo de discos foliares establecido por Horsch et al.
* * *El método de cultivo es un método de cocultivo de Agrobacterium y protoplastos de plantas para lograr la transformación. Los procedimientos incluyen la transformación de protoplastos de la pared celular primaria con Agrobacterium, la detección de células transformadas, la inducción de la diferenciación de las células transformadas y la regeneración de plantas.
El método del disco de hoja es en realidad un método de transformación creado mejorando el método de cultivo * * *. Infección de explantes de hojas con Agrobacterium y cultivo de corta duración. Durante el proceso de cultivo, se induce el gen vir de Agrobacterium y su activación puede iniciar la transferencia de ADN-T a las células vegetales. * * *Después del cultivo, se requieren pasos tales como seleccionar explantes transformados, cultivar callos, inducir la diferenciación y otros pasos para obtener plantas regeneradas. El método del disco foliar es un buen método para utilizar explantes de plantas como materiales transgénicos porque no requiere manipulación de protoplastos y es sencillo y rápido para obtener plantas transformadas.
La transformación genética mediada por Agrobacterium es un método común para transformar la mayoría de las plantas dicotiledóneas. Sin embargo, debido a la limitación del huésped de Agrobacterium, las plantas monocotiledóneas rara vez se infectan, especialmente algunos cultivos importantes como el arroz, el trigo y el maíz no son susceptibles a Agrobacterium, por lo que es difícil aplicar este método para la transformación genética.
Además de la transformación genética mencionada anteriormente utilizando el plásmido Ti como vector, también se pueden utilizar liposomas como vector para la transformación genética. Los liposomas son estructuras similares a membranas compuestas de fosfolípidos, por lo que las moléculas de ADN pueden envolverse en liposomas para evitar la degradación por las enzimas del ADN en las células receptoras e introducirse en los protoplastos de las plantas.
(II) Métodos de transferencia directa de genes Se refiere a algunos métodos de transferencia de genes que no dependen de Agrobacterium u otros vectores o medios.
1. La estimulación eléctrica y la inyección eléctrica pueden cambiar la permeabilidad de las membranas celulares. El método de introducir ADN exógeno en los protoplastos de las plantas mediante estimulación eléctrica de pulsos eléctricos de alto voltaje se llama electroporación. Este método se ha utilizado ampliamente para la transferencia de genes en plantas y animales monocotiledóneas y dicotiledóneas. Por ejemplo, a finales de la década de 1980, este método se utilizó para transferir el gen de la neomicina fosfotransferasa (NPT) a protoplastos de una línea endogámica de maíz y regenerar las plantas.
El método de introducir genes directamente en células o tejidos vegetales intactos mediante tecnología de estimulación eléctrica se llama electroinyección. Este método evita las complejas operaciones y dificultades del cultivo de protoplastos y la regeneración de plantas, y tiene un gran potencial de aplicación.
2. Método de pistola genética El método de pistola genética también se denomina bombardeo de partículas. Este método utiliza una pistola de partículas para inyectar partículas metálicas con ADN extraño adsorbido en la superficie en células o tejidos vegetales a alta velocidad. Este método ha atraído mucha atención porque es rápido y simple, no está limitado por el rango de huéspedes, no requiere la eliminación de las paredes celulares de las células de la planta receptora, tiene una alta tasa de transformación y las células o tejidos transformados pueden regenerar plantas fácilmente. .
3. Método de microinyección La microinyección utiliza un microinyector para inyectar directamente genes extraños o ADN en el núcleo o citoplasma de la célula a través de medios mecánicos. En comparación con otros métodos, este método es más directo y eficaz a la hora de introducir material genético exógeno.
La microinyección no sólo se utiliza para células vegetales, en los últimos años se ha desarrollado para inyectar directamente el ovario de la planta, lo que favorece más la transformación del material genético exógeno en embriones inmaduros. Nuestro país comenzó a explorar teórica y prácticamente el trabajo en este campo en la década de 1970, y obtuvo plantas de algodón transformadas que son resistentes a la marchitez por fusarium y algodón resistente a los insectos.
2. La tecnología de los animales transgénicos y su aplicación
(1) El concepto de animales transgénicos es introducir genes extraños de interés en células germinales, células madre embrionarias y embriones tempranos mediante ingeniería genética. tecnología, e integrado de manera estable en el cromosoma receptor, obteniendo así individuos que pueden heredar el gen extraño de interés para las generaciones futuras a través de diversas vías de desarrollo, es decir, animales transgénicos. El gen diana transferido se llama transgén y el proceso de transferencia del gen diana se llama transgén. El concepto de "transgénico" suele limitarse a la transferencia de genes en animales y plantas mediante tecnología de ingeniería genética, por lo que la adquisición de nuevos genes mediante cruces sexuales o asexuales entre variedades no entra en esta categoría.
(2) Tecnología animal transgénica La tecnología animal transgénica es una biotecnología desarrollada a principios de la década de 1980 que supera el aislamiento reproductivo entre especies y realiza el intercambio y la recombinación de material genético entre especies animales. Dependiendo del método y objeto de la introducción de genes exógenos, existen tres formas principales de producir animales transgénicos: microinyección, retrovirus y células madre embrionarias. Los métodos básicos de transferencia de genes retrovirales se han presentado brevemente antes. Aquí solo presentamos dos métodos, el método de microinyección y el método de células madre embrionarias.
1. La tecnología de microinyección de pronúcleo en óvulos fecundados se desarrolló a partir de experimentos de transferencia nuclear en embriología animal. A principios de la década de 1980, la gente utilizó este método para transferir genes extraños a células germinales animales y establecer ratones transgénicos con éxito. En 1985 se introdujeron ovejas y cerdos genéticamente modificados. Desde entonces, ratones, conejos, gallinas, vacas, peces, etc. modificados genéticamente. Éxito tras éxito. Se puede observar que la microinyección es una tecnología ampliamente utilizada y más eficaz para la obtención de animales transgénicos.
Bajo un microscopio, se inserta directamente un tubo de vidrio con un diámetro de aproximadamente 1 μm en el pronúcleo masculino del óvulo fertilizado, el ADN del gen extraño en el tubo capilar se inyecta en el pronúcleo y luego se trasplanta. en la trompa de Falopio o el útero de la madre pseudoembarazada, se desarrollan hasta convertirse en descendencia. Para comprender la integración del transgén, se puede utilizar hibridación por transferencia puntual, reacción en cadena de la polimerasa o hibridación Southern para detectar el ADN de los individuos descendientes, según corresponda.
La ventaja del método de microinyección es que el fragmento del gen extraño introducido puede tener hasta 50 kb de largo y no requiere un vector, por lo que la tasa de integración del gen extraño en el cromosoma del huésped es relativamente alta. Su desventaja es que la integración de genes extraños es aleatoria, por lo que es difícil controlar su tasa de integración y si los genes extraños pueden integrarse de manera estable en el genoma receptor solo se puede determinar después de que nazca la descendencia, lo que no es propicio para la integración; crecimiento y producción durante el período de crecimiento. Aplicado a ganado grande con camada pequeña.
2. Las células madre embrionarias (ES) se refieren a células embrionarias indiferenciadas aisladas de la masa celular de la etapa de blastocisto de embriones de mamíferos. Tienen totipotencia de desarrollo y pueden diferenciarse en varios tipos de células. A mediados de la década de 1980, se empezaron a estudiar métodos para utilizar células ES para obtener animales transgénicos. Este método consiste en introducir genes extraños directamente en las células es y luego inyectarlos en la cavidad del blastocisto del receptor después del cribado in vitro, donde se agregarán con las células del blastocisto y pasarán a formar parte del embrión receptor, participando en su diferenciación. A partir de este embrión se desarrollan animales transgénicos con quimeras, es decir, algunos tejidos provienen de células ES de donantes que integran genes extraños. Durante el proceso de quimerismo, las células germinales diferenciadas de las células ES transformadas pueden transmitir los genes extraños introducidos mediante hibridación.
En la tecnología de obtención de animales transgénicos a partir de células madre embrionarias, se pueden introducir genes extraños en las células es de varias maneras. La identificación y el cribado de las células son convenientes, y el número de copias de los genes extraños se puede predeterminar. a nivel celular, niveles de localización y expresión, así como la estabilidad de la inserción, la operación de inyectar células ES en blastocistos es simple y la tasa de integración es relativamente alta. Pero el establecimiento de líneas de células ES en sí es una tarea muy ardua. Aunque se han establecido líneas celulares ES de ratón, aún no se han obtenido líneas celulares ES verdaderamente estables en cerdos y ovejas.
(3) Aplicación de los animales transgénicos La investigación sobre animales transgénicos es muy extensa. Desde los años 1980 y 1990, ha habido un gran desarrollo en profundidad y amplitud desde la teoría básica hasta la tecnología aplicada, pasando gradualmente del laboratorio a la práctica de producción.
1. Aplicación en el estudio de la regulación de la expresión génica Los animales transgénicos pueden utilizarse como "reactores" para estudiar la regulación de la expresión génica exógena in vivo. Aquí tomamos como ejemplos los elementos reguladores cis del ADN y la regulación espaciotemporal de los genes en desarrollo.
(1) Investigación sobre elementos reguladores cis Los niveles anormales de lipoproteínas están relacionados con enfermedades como la aterosclerosis. Hay cinco tipos de lipoproteínas en los humanos, cada una de las cuales contiene una apolipoproteína diferente. Se han descubierto unas 17 apolipoproteínas y se han secuenciado sus genes codificantes. Son genes candidatos para el estudio de enfermedades cardiovasculares. La transferencia del gen de la apolipoproteína a ratones se puede utilizar para estudiar el metabolismo, la regulación y la aterosclerosis de las lipoproteínas en humanos. Al estudiar los elementos reguladores en cis de la expresión tisular específica de genes de apolipoproteínas, se descubrieron dos grupos de expresión tisular específica de genes de apolipoproteínas (Figura 19-15). Un grupo que incluye los genes A-ⅰ, C-ⅲ y A-ⅳ está ubicado en las regiones 2 y 3 del cromosoma humano 11 (11q 23), compuesto en el orden de A-ⅰ, C-ⅲ y A-ⅳ. La dirección de transcripción de C-ⅲ es opuesta a la de los otros dos genes. A-ⅰ y C-ⅲ se expresan principalmente en el hígado y el intestino delgado, y A-ⅳ se expresa principalmente en el intestino delgado. El rango de -0,2 ~ -1,4 BP del gen C-ⅲ es la región que regula la expresión del gen A-ⅰ en el intestino delgado. Esta región también es un elemento regulador para la expresión de los genes C-ⅲ y A-ⅳ en el intestino delgado, lo que indica que este elemento puede regular la expresión de todo el grupo de genes de apolipoproteínas en el intestino delgado. Otro grupo de genes está ubicado en la región del brazo largo 3 del cromosoma 19 (19q13), que contiene los genes E, C-I y C-II, dispuestos en el orden de E, C-I y C-II. El gen e se expresa principalmente en el hígado y en la mayoría de los tejidos del cuerpo, pero el nivel de expresión es bajo. Posteriormente, se descubrió que existe una región reguladora entre el gen C-ⅰ y el gen C-ⅱ, que permite que el gen E se exprese a un alto nivel en el hígado. Esta región tiene aproximadamente 154 pb. Además, se ha confirmado que esta región reguladora también regula la expresión de otros dos genes de apolipoproteínas, C-ⅰ y C-ⅱ, en el hígado. expresión.
(2) Expresión y regulación de genes relacionados con el desarrollo Se pueden utilizar animales transgénicos para estudiar la regulación espaciotemporal de genes en desarrollo. Los genes de la globina son el mejor ejemplo para estudiar la regulación del desarrollo. El gen de la globina humana se divide en dos grupos, α y β, ubicados en los cromosomas 16 y 11 respectivamente, con longitudes de 30 kb y 60 kb respectivamente. Según el informe de 1993, para analizar la regulación del interruptor del gen de la globina humana en el gen completo de la β-globina, Peterson et al transfirieron un cromosoma artificial de levadura (YAC) que contenía un grupo de genes de β-globina humana de 248 kb de longitud. un pequeño en ratones. El análisis de expresión de este grupo de genes en ratones transgénicos mostró que sólo la β-globina humana se expresa en animales transgénicos adultos. En los animales de primera y segunda generación, se confirmó que el sitio β YAC está regulado por un interruptor de desarrollo de genes similares a la globina β, es decir, los genes de globina ε y γ se expresan en el saco vitelino y en una pequeña Una cantidad de γ se expresa en el hígado a los 14 días de edad y grandes cantidades de β, mientras que en animales adultos solo se expresa el ARNm del gen de la β-globina. Al mutar YAC en células de levadura mediante recombinación homóloga y luego introducir este YAC mutado en ratones, se puede estudiar en detalle el mecanismo regulador de los genes en todo el sitio, como la expresión genética de los genes de globina en el desarrollo y la diferenciación. Genes β inducidos por mutaciones dirigidas a un sitio en nodos de desarrollo, etc.
Además de la investigación antes mencionada sobre la regulación de la expresión genética, en los últimos años también se ha desarrollado rápidamente el desarrollo de animales transgénicos para modelos animales de enfermedades genéticas. Por ejemplo, la introducción del gen mutante del colágeno pro-αⅰ en el genoma del ratón puede producir ratones transgénicos similares a la osteodistrofia humana, lo cual es de gran importancia para comprender la patogénesis de las enfermedades genéticas humanas.
2. Para la preparación de productos genéticos
En animales transgénicos, las personas pueden obtener el producto genético diana a partir de la leche y la sangre del animal introduciendo la expresión del gen diana. Por tanto, los animales transgénicos pueden considerarse como un sistema de expresión animal completo para preparar un determinado producto genético. Estos animales genéticamente modificados suelen denominarse biorreactores animales.
En 1982, Palmiter transformó con éxito el gen de la hormona del crecimiento de ratas en ratones y obtuvo ratones con una alta expresión de la hormona del crecimiento. El tamaño aumentó significativamente, confirmando la viabilidad de utilizar animales transgénicos para producir productos genéticos exógenos. Informes de los últimos años han confirmado que las proteínas heterólogas, como la proteína del suero, pueden sintetizarse eficientemente en las glándulas mamarias del ganado transgénico (como los cerdos). Actualmente, el Reino Unido está estudiando la expresión de la α1 antitripsina humana y el factor de coagulación ⅸ en ovejas transgénicas mediante el control del promotor de la β-lactoglobulina de oveja y del promotor de la proteína del suero. En los Estados Unidos, se ha informado que el tPA y las gonadotropinas se expresan en la leche de ratones, ovejas lecheras y vacas transgénicas, respectivamente. En China también se está trabajando para utilizar animales genéticamente modificados como reactores para producir productos genéticos. Recientemente, unidades relevantes han obtenido eritropoyetina a partir de leche de cabra genéticamente modificada.
3. Mejora y mejora de razas animales
La introducción de genes con características excelentes o genes de resistencia a enfermedades en el ganado y las aves de corral y el cultivo de nuevas razas es un aspecto extremadamente importante en la investigación de animales genéticamente modificados. animales. Por ejemplo, se desarrolló una nueva cepa de pollo transgénico que es resistente al virus de la leucohistiocitosis del pollo. Para mejorar la resistencia del pescado a la congelación, se ha informado que los genes de la proteína anticongelante se expresan en el salmón transgénico. En 1985, el erudito chino Zhu inyectó por primera vez en el mundo el gen de fusión MT/HGH de ratón en huevos fertilizados de peces de colores y obtuvo un pez de colores transgénico cuya F1 era el doble que la de los peces transgénicos de la misma generación. En este experimento se obtuvieron sucesivamente otros peces transformados con genes de la hormona del crecimiento, como la carpa cruciana y la carpa.
3. Progreso de la investigación en tecnología transgénica
(1) Desarrollo de tecnología de aislamiento de genes Los genomas eucariotas son muy grandes y los antecedentes genéticos del genoma a menudo no están claros. No es fácil aislar el gen diana de una cantidad tan grande de ADN. Sin embargo, debido al rápido desarrollo de la bioquímica, la enzimología, la biología molecular y otras disciplinas, se proporcionan medios eficaces para el aislamiento de genes. Ahora se han desarrollado algunas tecnologías nuevas para aislar genes diana, como la PCR, etiquetas de transposones y tecnología de eliminación del genoma.
1. Tecnología de etiquetado de transposones El efecto genético más importante de la transposición de genes es provocar mutaciones de inserción, lo que significa que el gen en la posición de inserción se desactiva y provoca mutaciones, o aparece un nuevo gen en la posición de inserción. . Por lo tanto, se puede clonar un gen mutado usando un transposón como sonda, y luego se puede aislar y clonar el gen de tipo salvaje a partir de un individuo de tipo salvaje usando el gen mutado como sonda. Esta técnica de utilizar transposones para separar genes se denomina etiquetado de transposones (Figura 19-16). Una característica distintiva de esta tecnología es que permite aislar de antemano genes con productos de expresión desconocidos. Actualmente, los sistemas de transposones, como AC/DS en maíz y Tam3 en boca de dragón, se han estudiado bien a nivel molecular y pueden usarse para aislar genes de plantas heterólogas.
Cuando se usan transposones para aislar genes de plantas, primero es necesario construir un vector que contenga los transposones y los plásmidos, porque los transposones aislados y los marcadores de selección deben integrarse en el genoma del plásmido apropiado antes de poder usarse. Transformación genética de plantas diana. Los plásmidos utilizados actualmente para construir vectores transposones son principalmente el plásmido Ti y pBR322 de Agrobacterium tumefaciens. En segundo lugar, la transformación genética de las plantas objetivo, normalmente utilizando sistemas de vectores mediante transformación con Agrobacterium tumefaciens. El tercero es la detección de transposición y número de copias. Finalmente, detección y aislamiento de mutaciones de inserción de transposones. Para mutantes aislados, es necesario demostrar que la mutación es causada por la inserción de un transposón.
En los últimos años, algunos genes difíciles de aislar mediante métodos bioquímicos tradicionales se han aislado mediante marcadores de transposones, como los genes que controlan el desarrollo de pétalos y estambres en la boca de dragón, genes relacionados con la aparición y el desarrollo de flores y genes de resistencia a la roya del lino, etc. Estados Unidos, Países Bajos y otros países también han utilizado transposones para aislar genes de síntesis de ácidos grasos de semillas de Arabidopsis para estudiar la resistencia de las plantas a bacterias patógenas.
2. La tecnología de sustracción del genoma es otro método desarrollado en los últimos años basado en la PCR para aislar e identificar genes diana en función de la variación fenotípica. Se ha utilizado para aislar genes con antecedentes genéticos desconocidos en animales y plantas, como el aislamiento e identificación de genes de eliminación y reordenamiento de tumores, la preparación de sondas de sitios polimórficos, el aislamiento de genes de enfermedades genéticas y terapia génica, etc.
El concepto de utilizar la hibridación sustractiva para aislar secuencias faltantes fue propuesto por primera vez por Buatz. Utilizó el ADN del mutante de deleción del fago T4 para aislar el ARNm de la región eliminada correspondiente y lo logró. Posteriormente fue citado y mejorado por muchos laboratorios. En 1989, D. Stuarts y L. Wieland introdujeron la tecnología de PCR en la hibridación sustractiva respectivamente, promoviendo la aplicación de la tecnología de hibridación sustractiva del genoma. El principio básico de esta tecnología es utilizar rayos gamma para inducir mutaciones por eliminación en grandes segmentos de ADN y luego utilizar este ADN mutante para hibridar con ADN de tipo salvaje para eliminar el ADN mutante en el tipo salvaje. Después de repetirlo varias veces, la secuencia de ADN parental eliminada del ADN mutante se retuvo en el sistema de reacción. El sistema de perlas magnéticas de biotina-avidina o el sistema de cromatografía HAT-biotina-avidina se utiliza para enriquecer las secuencias faltantes y amplificarlas mediante PCR. Luego, las secuencias amplificadas se usan para hibridar con una biblioteca de genes de tipo salvaje para clonar el gen correspondiente al rasgo eliminado (Figuras 19-17).
Utilizando tecnología de hibridación sustractiva del genoma, se clonó con éxito el gen que contiene el locus GA1 de giberelina a partir de Arabidopsis thaliana. En la investigación médica, también hay informes sobre la clonación de sondas genéticas específicas de cromosomas humanos mediante hibridación sustractiva del genoma, como sondas para la distrofia muscular de Duchenne (DMD) y la coroideremia.
(2) Tecnología de eliminación de genes La tecnología de eliminación de genes, también conocida como tecnología de selección de genes, se desarrolló a finales de los años 1980. Este es un método de recombinación homóloga para establecer líneas celulares de inactivación dirigida al sitio de genes o para obtener actividad de inactivación dirigida al sitio de genes. En los últimos años, esta tecnología se ha aplicado a muchas áreas de investigación en biología y se han obtenido cientos de ratones con defectos en el mapeo genético.
El principio de la tecnología de eliminación de genes es insertar genes extraños en el fragmento del gen objetivo mediante recombinación genética como gen marcador de detección e inactivar el gen objetivo (mutación dirigida al sitio) y luego transformarlo (inactivado). gen en En las células madre pluripotentes embrionarias (células ES), el gen inactivado reemplaza el gen diana original en el cromosoma mediante recombinación homóloga de genes intracelulares. Después de la detección y el genotipado, las células ES con mutaciones específicas de sitio se inyectan en la cavidad del blastocisto del huésped y luego los embriones se implantan en el útero de la madre pseudoembarazada para convertirse en quimeras con defectos genéticos diana (mutación). la descendencia se autofecunda, se eliminan los homocigotos con el defecto del gen diana, es decir, los animales con gen knockout.
Los pasos experimentales específicos para la eliminación genética son los siguientes: primero, diseñar y construir un vector de recombinación homóloga, es decir, seleccionar una secuencia de cierta longitud (5 a 7 KB o más) que sea homóloga a la región funcional del gen diana e insertar genes marcadores selectivos (como el gen neo de resistencia a la neomicina, etc.) facilitan la detección. También se pueden conectar genes marcadores de selección negativa (tales como el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple, etc.) a uno o ambos extremos de esta secuencia homóloga. El vector de recombinación homóloga se transfecta en células diana mediante métodos como la electroporación. Se examinó la resistencia a los medicamentos de los clones de células recombinantes y se identificó el genotipo de las células recombinantes mediante PCR e hibridación Southern. En este punto, se obtienen células heterocigotas a las que se les ha eliminado un único alelo. Para establecer líneas celulares knockout bialélicas, es necesario subcultivar una gran cantidad de células knockout monoalélicas, luego examinarlas repetidamente en medios selectivos de mayor concentración y, finalmente, se identifican los genotipos de los clones positivos.
En términos de aplicación, al explorar los efectos espaciotemporales de las mutaciones de genes diana en la ontogenia de animales knockout y analizar las anomalías fenotípicas causadas por defectos de un solo gen en el cuerpo, podemos estudiar la función y regulación de los genes, y Establecer enfermedades y terapias genéticas. Por lo tanto, es de gran importancia estudiar la desactivación genética a nivel celular. Por ejemplo, en los últimos años, informes extranjeros han informado sobre el establecimiento de animales con genes knockout para la apolipoproteína E (apoE) y el receptor de lipoproteínas de baja densidad para el estudio de enfermedades cardiovasculares.
El establecimiento de líneas celulares con genes eliminados puede descubrir directamente el efecto de la eliminación de genes específicos, dilucidar la función de los genes y preparar modelos celulares con genes eliminados para la investigación sobre patogénesis o terapia génica. La recombinación homóloga en células somáticas es diferente de la de las células ES. Generalmente, solo es necesario inactivar un alelo del cromosoma homólogo para obtener animales homocigotos con genes knockout en la descendencia de quimeras. Sin embargo, para inactivar un gen específico a nivel somático, se debe inactivar un par de alelos; de lo contrario, no se puede estudiar su función.
Actualmente existen dos métodos que pueden lograr este objetivo con éxito: uno es utilizar dos vectores de recombinación homóloga con diferentes genes marcadores para realizar la recombinación homóloga en las células objetivo dos veces, el otro es subcultivar un solo alelo de un gen para inactivar la línea celular; aumentar la concentración de resistencia del producto del gen marcador y utilizar el efecto acumulativo de la expresión del gen marcador para detectar clones celulares naturales en la línea celular que eliminan ambos alelos.