Métodos de detección inmunológica
1. El método de inmunidad humoral utiliza principalmente la combinación específica de antígenos y anticuerpos correspondientes in vitro, y reacciona con la participación de algunos cofactores para detectar anticuerpos o antígenos desconocidos con antígenos o anticuerpos conocidos. Además, también incluye la detección de diversas moléculas inmunes solubles en fluidos corporales, como complemento, inmunoglobulinas, complejos circulantes, lisozima, etc.
2. El análisis inmunológico celular consiste en determinar varias células inmunes en función de los marcadores únicos y las citocinas producidas en la superficie de varias células inmunes (células T, células B, células K, células NK, macrófagos, etc.). ) y el número y función de sus subpoblaciones. ) para ayudar a comprender el nivel de inmunidad celular del cuerpo.
Inmunoensayo humoral
1.
Las partículas de antígenos (bacterias o glóbulos rojos, etc.) se unen específicamente a los correspondientes anticuerpos y, en presencia de electrolitos, forman agregados visibles a simple vista, lo que se denomina reacción de aglutinación.
1) Reacción de aglutinación directa. El fenómeno de aglutinación es causado por la combinación directa de antígenos de partículas y los anticuerpos correspondientes. Los primeros son en su mayoría componentes estructurales en la superficie celular, como antígenos estructurales de superficie de bacterias o glóbulos rojos. ⑴ Método de diapositiva: se utiliza principalmente para la detección cualitativa de antígenos. ⑵ Método del tubo de ensayo: se utiliza principalmente para la detección cuantitativa de anticuerpos.
2) Reacción de aglutinación indirecta. Los antígenos solubles se adsorben en la superficie de las partículas portadoras (como partículas de látex, glóbulos rojos, etc.). ), también conocidas como partículas sensibilizantes. La aglutinación se produce cuando las partículas sensibilizadas se unen a los anticuerpos correspondientes. Esta reacción se utiliza comúnmente para determinar anticuerpos bacterianos, anticuerpos virales, anticuerpos contra Leptospira y Treponema pallidum y algunos autoanticuerpos (como anticuerpos antinucleares, anticuerpos antiriñón, anticuerpos antitiroideos, etc.).
Según el principio de reacción de aglutinación, existen pruebas de inhibición de aglutinación indirecta, pruebas de aglutinación indirecta inversa y pruebas de aglutinación sinérgica.
2. Reacción de precipitación.
Los antígenos solubles (exotoxinas, suero, filtrado de cultivo bacteriano, lixiviado de tejido, etc.) se unen específicamente a los anticuerpos correspondientes y forman una precipitación con la participación de electrolitos, lo que se denomina reacción de precipitación. Los antígenos en la reacción de precipitación son principalmente polisacáridos, lípidos, proteínas, etc.
1) Ensayo de difusión unidireccional. Esta es una prueba cuantitativa de antígeno, que es una reacción de precipitación en la que el antígeno soluble se difunde en un medio de agar que contiene anticuerpos. Este método se usa comúnmente para detectar los niveles de inmunoglobulinas séricas y componentes del complemento.
2) Ensayo de difusión bidireccional. Se trata de una reacción de precipitación en la que antígenos y anticuerpos solubles se difunden entre sí en medios de agar. Este método se utiliza a menudo para pruebas cualitativas, como la detección de inmunoglobulinas séricas, alfafetoproteína, antígeno de superficie de la hepatitis B, etc. Tecnología de anticuerpos monoclonales
3) Inmunoelectroforesis a contracorriente. La electroforesis por convección es un método de detección rápido y sensible, que es una inmunodifusión bidireccional bajo la acción de un campo eléctrico. Este método se utiliza comúnmente para detectar el antígeno de superficie de la hepatitis B y la alfafetoproteína en suero.
3.Prueba de neutralización.
Los anticuerpos específicos pueden inhibir la actividad de la sustancia antigénica correspondiente, y la reacción en la que el anticuerpo elimina la toxicidad o infectividad del antígeno correspondiente es una prueba de neutralización. Por ejemplo, las antitoxinas neutralizan la toxicidad de las exotoxinas y los anticuerpos neutralizantes del virus pueden hacer que el virus pierda su infectividad. La prueba de toxina antiestreptocócica "O" que se utiliza para diagnosticar la fiebre reumática también es una prueba de neutralización. El estreptococo B hemolítico puede producir una toxina hemolítica "O" que puede disolver los glóbulos rojos en humanos y conejos. La toxicidad hemolítica de esta toxina puede neutralizarse mediante anticuerpos anti-toxina hemolítica "O" sin provocar hemólisis. En el experimento, el suero del paciente se mezcló con la toxina hemolítica "O" y después de un período de tiempo, se agregaron glóbulos rojos humanos, pero los glóbulos rojos no se disolvieron en una reacción positiva, lo que indica que había anticuerpos contra la toxina hemolítica "O" en el suero del paciente. Cuando el título de anticuerpos séricos alcanza más de 400 unidades, indica que el paciente ha sido infectado con Streptococcus B hemolítico, lo que es útil para el diagnóstico de fiebre reumática.
4. Método de inmunofluorescencia (método de anticuerpos fluorescentes).
Los colorantes de fluoresceína (como el isotiocianato de fluoresceína, etc.) se utilizan para marcar anticuerpos sin afectar a su actividad. Estos anticuerpos se denominan anticuerpos fluorescentes. Las células o secciones de tejido que contienen el antígeno a detectar se impregnan con anticuerpos fluorescentes de especies conocidas. Si hay un antígeno correspondiente, el antígeno se unirá específicamente al anticuerpo, formando un complejo que se adhiere a las células, es difícil de eluir y se convierte en un objeto fluorescente visible bajo un microscopio de fluorescencia, logrando así el propósito de diagnóstico o localización. Incluyendo método directo y método indirecto.
5. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.
El principio de este método es utilizar un antígeno o anticuerpo marcado con una enzima (comúnmente utilizada peroxidasa de rábano picante) para determinar si el antígeno o anticuerpo correspondiente está presente en la muestra que se está analizando.
Hay tres métodos: método indirecto, método de doble anticuerpo y método de competencia.
6. Prueba de placa de hemólisis.
7. Tecnología de transferencia Western.
Técnicas de inmunotransferencia o inmunoextensión en el Sur (1975).
Reacción anticuerpo-antígeno
Una nueva tecnología inmunobioquímica desarrollada a partir de la transferencia Southern.
Inmunoensayo celular
La inmunología moderna utiliza ampliamente técnicas como la biología celular, la serología inmune, el marcaje inmunológico y la inmunohistoquímica. , y ha desarrollado y mejorado continuamente una serie de tecnologías de detección inmune celular para detectar marcadores de superficie de diversas células inmunes (incluidos antígenos y receptores), activación celular, proliferación, fagocitosis y funciones de destrucción, y la actividad de diversas citocinas o contenidos. Estas tecnologías proporcionan medios útiles para el estudio y la comprensión en profundidad de los cambios fisiológicos y patológicos del sistema inmunológico del cuerpo, y para dilucidar la patogénesis y el diagnóstico clínico y el tratamiento de determinadas enfermedades. Con el rápido desarrollo de la inmunología celular, constantemente surgen nuevas tecnologías de análisis de inmunidad celular. A principios de la década de 2000, nuevos proyectos desarrollados se centraron en la detección de citocinas y receptores celulares.
1.Test de transformación de linfocitos.
Cuando los linfocitos humanos se incuban con antígenos específicos (como la tuberculina) o mitógenos no específicos (como la fitohemaglutinina, PHA) in vitro, las células T se activan y se convierten en linfocitos. La transformación de las células T puede ir acompañada de un aumento de la síntesis de ADN, ARN y proteínas, lo que en última instancia conduce a la división celular. La tasa de transformación de los linfocitos se puede determinar contando el número de linfocitos transformados bajo un microscopio óptico, o incorporando timidina marcada con tritio (3H-TdR) en los linfocitos en división y midiendo la cantidad incorporada con un analizador de centelleo líquido. En el año 2000 comenzó a aparecer un método de detección de la respuesta de proliferación de linfocitos que podía medirse mediante instrumentos sin isótopos, llamado método MTT. MTT es una sal de metoxazol, que es un sustrato para la deshidrogenasa mitocondrial intracelular. La enzima intracelular puede descomponer el MTT para producir un componente negro azulado. La cantidad de este producto es directamente proporcional al número de células viables. Resultados: La densidad óptica se puede medir con un lector de microplacas (595 nm) y usarse como indicador de detección de MTT.
2.Método E-guirnalda.
Hay un receptor de células de oveja (CD2) en la superficie de las células T humanas, que puede combinarse con los glóbulos rojos de oveja para formar una estructura en forma de roseta. Es decir, la suspensión de células mononucleares periféricas separada del fluido de separación se mezcla con glóbulos rojos de oveja in vitro, se incuba a 37°C durante 5 a 10 minutos y luego se deja a 4°C durante la noche y se cuenta la suspensión de células. Alrededor del 70% al 80% de los linfocitos de sangre periférica forman rosetas, que son células T. Este método se puede utilizar para aislar células T.
3. Detección de subconjuntos de células T.
4.Prueba de citotoxicidad.
Las células Tc, las células NK, las células LAK y las células TIL tienen efectos citotóxicos (destructores) directos sobre sus células diana.
Preparación de anticuerpos
El método de detección comúnmente utilizado es el método de liberación de 51Cr (cromo). La solución salina de 51Cr-Na2CrO4 se incuba con células diana (diferentes células requieren diferentes células diana, como K562) a 37°C durante aproximadamente 1 hora. El 51Cr entrará en las células diana y se combinará con el citoplasma. Se pueden obtener células diana marcadas con 51Cr. Las células cuya citotoxicidad se va a analizar se mezclan con células diana marcadas con 51Cr (en una proporción de aproximadamente 50:1 o 100:1). Cuantas más células objetivo se matan, más 51Cr libre se libera en el sobrenadante, lo que no se puede lograr. La detección de citotoxicidad es de gran valor para la inmunidad tumoral.
5. Determinación de la función de fagocitosis de macrófagos.
Colocar papel de filtro (1cm2) empapado en extracto etanólico de medicina tradicional china (10% cantaris) sobre la piel del lado flexionado del antebrazo del sujeto, y retirar el papel de filtro después de 4-5 horas. En 48 horas, la piel puede presentar ampollas locales y contener macrófagos. Tome 0,5 ml de líquido de vesículas y 0,01 ml de suspensión de glóbulos rojos de pollo, frote, tiña e inspeccione microscópicamente a 37°C durante 30 minutos. Calcule el porcentaje de fagocitosis y el volumen de fagocitosis promedio de los glóbulos rojos de pollo por cada macrófago. Este experimento ayuda a observar el estado y la eficacia del tumor.
6.Prueba de inhibición motora.
Cuando los linfocitos sensibilizados vuelven a entrar en contacto con su antígeno específico, pueden producir factor inhibidor de la migración (MIF). Este factor puede inhibir el movimiento de macrófagos y neutrófilos, localizarlos y mejorar su función inmune.
Este experimento se utiliza para observar in vitro si los linfocitos del sujeto son estimulados por antígenos específicos, determinando así la función de la respuesta inmune celular específica del cuerpo a un determinado antígeno.
7. Tecnología de medición de fluorescencia resuelta en el tiempo.
La medición de fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF) es una nueva tecnología de análisis no radiactivo de ultratrazas. La sensibilidad y especificidad de esta tecnología son similares a la medición de radionúclidos, pero no tiene las desventajas de la medición radiactiva. Por lo tanto, existe desde hace poco tiempo, pero está progresando rápidamente y tiene el potencial de reemplazar la medición radiactiva.
8. Tecnología de detección de citocinas.
Desde 2005, la detección de citoquinas se ha utilizado ampliamente en entornos clínicos y de laboratorio de la medicina tradicional china.
9. Detección de receptores celulares.
El receptor es uno de los marcadores de la superficie celular. Mediante la detección de receptores podemos comprender las funciones de las células y proporcionar algunas bases teóricas para la patogénesis de determinadas enfermedades.