¿Qué es la síntesis in situ?
Con la finalización del proyecto del genoma humano, es decir, la secuenciación de todos los nucleótidos, el foco de la investigación del genoma humano ha entrado gradualmente en la era posgenómica. centrándose en la función genética y la diversidad genética. Mediante el análisis paralelo de la expresión de una gran cantidad de genes en individuos en diferentes etapas de crecimiento y desarrollo o en diferentes estados fisiológicos, podemos estudiar las funciones de los genes correspondientes en el organismo y dilucidar el mecanismo de sinergia de múltiples genes en diferentes niveles. , mejorando así el tratamiento de enfermedades humanas como el cáncer y las enfermedades cardiovasculares. Desempeña un papel muy importante en la patogénesis, el diagnóstico y el tratamiento, y la investigación y el desarrollo de fármacos de las principales enfermedades. Promoverá en gran medida proyectos de investigación genómica sobre el genoma estructural y funcional humano.
El principio de funcionamiento del chip genético es consistente con el método clásico de hibridación de moléculas de ácido nucleico (sur, norte), utilizando una secuencia de ácido nucleico conocida como sonda para hibridar con una secuencia de nucleótidos diana complementaria, y mediante señales posteriores La detección se realiza cualitativa y cuantitativamente. Los chips genéticos integran un gran número de sondas de reconocimiento molecular en la superficie de sustratos diminutos (obleas de silicio, portaobjetos de vidrio, láminas de plástico, etc.). ), puede analizar una gran cantidad de genes en paralelo al mismo tiempo y realizar análisis de detección y detección de una gran cantidad de información [3 Los principales procesos técnicos de los chips genéticos incluyen: diseño de chips y etiquetado de genes objetivo; hibridación y detección de señales de hibridación.
El diseño de chips genéticos en realidad se refiere a la selección y disposición de secuencias de sondas de ácido nucleico en el chip. El método de diseño depende del propósito de su aplicación. El ámbito de aplicación actual incluye principalmente el análisis de perfiles de expresión y transcripción génica y la detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) o puntos de mutación en secuencias diana. El propósito del chip de expresión es detectar cuantitativamente las diferencias de expresión de miles de genes en diferentes muestras (diferentes tejidos, diferentes etapas de desarrollo y diferentes estimulación farmacológica) en experimentos de hibridación. Las secuencias de sonda generalmente provienen de bibliotecas de ADNc o EST de genes conocidos cuando se diseñan para garantizar la unión específica al gen diana que se va a probar. Para el mismo gen diana, se pueden diseñar múltiples sondas con secuencias que no se superpongan para que los datos finales sean más precisos.
Confiable. Los chips que detectan polimorfismos de una sola base genética generalmente utilizan el método de diseño de desplazamiento de igual longitud [5], es decir, se toma una secuencia de nucleótidos complementaria de una determinada longitud de principio a fin para formar una combinación de sondas basada en la secuencia objetivo. La combinación es completamente idéntica a la secuencia diana que coincide con las sondas de tipo salvaje, luego, para cada sonda de tipo salvaje, una base en la posición media se reemplaza por otras tres bases, lo que da como resultado tres sondas de nucleótidos diferentes con cambios de una sola base. Este diseño puede escanear todos los SNP posibles de una determinada secuencia de ácido nucleico.
Los métodos de preparación del chip incluyen principalmente dos tipos: (1) Método de localización: el primero es la preparación de la biblioteca de sondas. De acuerdo con los objetivos de análisis del chip genético, se seleccionan secuencias específicas de la base de datos de genes correspondiente. para amplificación por PCR o sintetizar artificialmente directamente secuencias de oligonucleótidos [6], y luego usar una plataforma de trabajo tridimensional controlada por computadora para usar agujas y microboquillas especiales para distribuir diferentes soluciones de sonda punto por punto en diferentes sitios de la superficie de sustratos sólidos como vidrio y nailon y fijados con métodos físicos y químicos. Este método es maduro en todos los aspectos técnicos, es flexible y adecuado para que las unidades de investigación preparen chips genéticos de tamaño de red moderado según las necesidades. (2) Método de síntesis in situ
[7 ~ 10]: este método sintetiza directamente matrices de sondas de oligonucleótidos en superficies duras como el vidrio. En la actualidad, las principales aplicaciones incluyen el método de síntesis paralela por fotodesprotección, el método de síntesis de impresión piezoeléctrica, etc. Las tecnologías clave son la tecnología de posicionamiento de plantillas de alta resolución espacial y la tecnología de síntesis química de ADN de alto rendimiento, que son adecuadas para fabricar chips de sonda de ADN a gran escala y realizar la estandarización y producción a gran escala de chips de alta densidad.
La preparación de las muestras a analizar es un paso importante en el proceso experimental del chip genético. El gen diana debe separarse, amplificarse y marcarse antes de combinarse con la sonda del chip. Los métodos de etiquetado varían según la fuente de la muestra, el tipo de matriz y el propósito de la investigación. El gen diana suele marcarse durante el proceso de amplificación por PCR, transcripción inversa o transcripción in vitro de la muestra a analizar. La detección en chip de los niveles de expresión de ARNm intracelular generalmente requiere la extracción de ARN de células y tejidos, la transcripción inversa y la adición de dNTP acoplados a marcadores para completar el proceso de etiquetado de los genes diana [11]. Para chips con una densidad de matriz más pequeña, se pueden usar isótopos y los instrumentos necesarios se usan comúnmente en laboratorios para facilitar el trabajo relacionado. Sin embargo, en la detección de señales, es fácil hibridar alguna red con una señal fuerte.
Produce halos que interfieren en el análisis de las señales circundantes.
En el análisis de chips de alta densidad, los genes diana generalmente se marcan con fluoresceína. Al establecer controles internos apropiados y estandarizar la intensidad de la señal de fluorescencia, se puede detectar cuantitativamente la expresión del ARNm intracelular. En los últimos años, la tecnología de etiquetado fluorescente multicolor puede comparar de manera más intuitiva las diferencias en la expresión genética en muestras de diferentes fuentes, es decir, los genes diana de diferentes fuentes se marcan con fluoresceínas de diferentes longitudes de onda de excitación y se hibridan con chips genéticos al mismo tiempo. comparando la fluorescencia de diferentes longitudes de onda en el chip, mapa de distribución para obtener un mapa de genes expresados diferencialmente entre diferentes muestras [12, 13]. Los reactivos fluorescentes de dos colores de uso común incluyen Cy3-dNTP y Cy5-dNTP. La tecnología de fluorescencia multicolor puede mejorar en gran medida la precisión y el rango de detección de los chips genéticos para la detección de polimorfismos y mutaciones, como el uso de diferentes fluoróforos para marcar secuencias objetivo y secuencias de referencia que no coinciden con una sola base, respectivamente, e hibridarlas con el chip al mismo tiempo. y obtener información sobre los desajustes de bases en la secuencia objetivo comparando diferentes intensidades de fluorescencia [14].
El proceso de hibridación entre el chip genético y el gen objetivo es básicamente el mismo que el proceso de hibridación molecular general. Las condiciones de la reacción de hibridación deben optimizarse según la longitud de la sonda y el contenido de bases de GC. y el tipo de chip. Por ejemplo, si se usa para la detección de expresión genética, la rigurosidad de la hibridación es baja, mientras que la temperatura de hibridación del chip usado para la detección de mutaciones es alta, el tiempo de hibridación es corto y las condiciones son relativamente estrictas. Si el gen diana está marcado con un isótopo, la detección de la señal posterior se realiza mediante autorradiografía. Si el gen diana está marcado con fluorescencia, se requiere un sistema de análisis de escaneo de fluorescencia para analizar y comparar la intensidad de la fluorescencia en la matriz de sondas correspondiente para obtener la información correspondiente de la muestra que se va a analizar. Debido a la gran cantidad de información obtenida por los chips genéticos, se necesita un formato de datos estándar para analizar, procesar, consultar y comparar los datos de hibridación de los chips genéticos. Actualmente, se dispone de una base de datos a gran escala
Mientras se construye la base de datos del chip, los resultados del chip genético obtenidos por varios laboratorios están centralizados para facilitar el intercambio de datos y la evaluación y análisis de los resultados.
2 Aplicaciones de los chips genéticos
El mapeo de expresión genética es actualmente el campo más utilizado de los chips genéticos y también es una parte importante del Proyecto Genoma Humano. Proporciona información para el análisis general de la expresión celular, proporciona una herramienta poderosa para comprender la expresión genética relacionada con ciertos fenómenos especiales de la vida y desempeña un papel importante en la discusión sobre la regulación genética y los mecanismos de interacción genética [15 ~ 19]. El genoma humano codifica aproximadamente 100.000 genes diferentes, por lo que es importante contar con herramientas experimentales para monitorear grandes cantidades de ARNm. La tecnología de chips genéticos puede detectar clara y directamente el ARNm en un nivel de 1:300.000 y es fácil monitorear miles de genes simultáneamente [16]. Actualmente, es posible sintetizar y leer una matriz que contiene 400.000 sondas en un área de 1,6 cm2 y que puede monitorear 10.000 genes.
Situación de expresión. Brown, de la Universidad de Stanford, utilizó el chip de ADNc de levadura preparado para obtener el mapa de expresión de 2473 genes de levadura en diferentes estados del ciclo celular y después del tratamiento con choque térmico y frío [19], que refleja intuitivamente la transcripción genética en diferentes condiciones y estados de regulación. , proporcionando así una forma eficaz de encontrar el mecanismo de regulación genética.
El seguimiento cuantitativo de los niveles de expresión de un gran número de genes es de gran valor para explicar las funciones de los genes, explorar las causas y mecanismos de las enfermedades y encontrar posibles genes diana para el diagnóstico y el tratamiento. Derisi et al. seleccionaron 1161 clones de ADNc de la línea celular de tumores malignos UACC903 para fabricar un chip. Al comparar las diferencias de expresión entre células normales y células tumorales, se encontró que el gen P21 estaba inactivado o desactivado en células tumorales malignas, pero se expresaba altamente en líneas celulares invertidas [17]. Golub et al. utilizaron chips de ADNc para detectar diferencias en la expresión genética y distinguieron con éxito la leucemia mieloide aguda (LMA) de la leucemia linfoblástica aguda (LLA). Se espera que este método también pueda diagnosticar nuevos tipos de leucemia [20]. En los estudios de expresión genética de enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoide (AR) y la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), se pueden detectar genes inducidos por enfermedades inflamatorias como TNF-α, IL o factor estimulante de colonias de granulocitos. descubrirse, como los genes HME y los factores estimulantes del crecimiento del melanoma [11, 21]. Actualmente, una gran cantidad de tecnologías ecológicamente racionales humanas proporcionan ricos recursos de secuencias para micromatrices de ADNc. Las EST en la base de datos representan genes humanos, por lo que las micromatrices de EST se pueden utilizar para el descubrimiento de genes y la detección de la expresión genética sin otra información de secuencia, acelerando así el proceso de análisis funcional del genoma humano.
Otra aplicación importante de los chips genéticos es la detección de sitios de polimorfismo genético y mutaciones genéticas. Un gran número de ejemplos existentes muestran que el estudio de la diversidad genómica es de gran importancia para dilucidar las diferencias en la susceptibilidad y resistencia a las enfermedades entre diferentes poblaciones e individuos. Una vez que las secuencias codificantes del genoma se analizan sistemáticamente, es posible descubrir un gran número de variantes genéticas asociadas con la susceptibilidad a enfermedades [2]. La tecnología de chips genéticos puede detectar y analizar variaciones y polimorfismos del ADN a gran escala. Wang et al. utilizaron chips genéticos de alta densidad para detectar SNP en genes humanos de 2,3 Mb e identificaron 3241 SNP, lo que muestra la posibilidad de identificación a gran escala de genotipos humanos [22]. Lipshutz et al. utilizaron una micromatriz que contenía 18495 sondas de oligonucleótidos para detectar polimorfismos elevados en el gen de la transcriptasa inversa (rt) y el gen de la proteasa (pro) en el genoma del VIH-1. Estas mutaciones pueden hacer que el virus se vuelva resistente a una variedad de medicamentos antivirales, incluidos AZT, ddI, ddC, etc. Por lo tanto, la detección de variaciones y polimorfismos de rt y pro tiene una importancia clínica importante [Con el descubrimiento de una gran cantidad de genes relacionados con enfermedades, el análisis de variaciones y polimorfismos mostrará un valor cada vez más importante en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades. Affymetrix integra la secuencia completa del gen P53 y secuencias de mutaciones conocidas en sondas en el chip, que pueden usarse para el diagnóstico temprano de cánceres relacionados con mutaciones del gen P53. Hacia et al. utilizaron una matriz de alta densidad que contenía 96.600 20-oligodesoxinucleótidos [12] para detectar el exón 11 del gen BRCA1 en cáncer de mama y de ovario hereditario, y los resultados se encontraron en 15 muestras de pacientes con mutaciones conocidas14. Sin embargo, no se encontró ningún caso de falso positivo en 20 muestras de control, lo que indica que la sensibilidad y especificidad de la tecnología de chips de ADN para detectar posibles variantes heterocigotas en ciertos genes relacionados con enfermedades son satisfactorias.
La secuenciación por hibridación (SBH) en tecnología de chips es un método de secuenciación nuevo, eficiente y rápido, y también es otra aplicación importante de los chips genéticos [24]. El principio es similar a la detección de sitios polimórficos en un chip, es decir, la secuenciación mediante hibridación con un conjunto de sondas de ácido nucleico de secuencia conocida. Cuando la secuencia marcadora fluorescente que se va a medir se empareja con la sonda de ácido nucleico correspondiente en el chip genético, se obtiene un conjunto de secuencias de sonda complementarias determinando la posición de la sonda con la intensidad de fluorescencia más fuerte. Usando una micromatriz que contiene 65536 8-oligodesoxinucleótidos y tecnología SBH, se pueden determinar secuencias de ADN de 200 pb. Usando una micromatriz de 6710886413 oligodesoxinucleótidos, se pueden secuenciar secuencias de ADN de miles de bases.
3 Conclusión
La tecnología de chips genéticos solo existe desde hace unos pocos años y se ha desarrollado muy rápidamente. Se ha utilizado ampliamente en diversos campos de las ciencias de la vida, pero sus deficiencias son evidentes. también bastante obvio. La primera es la cuestión del coste. Debido al complejo proceso de fabricación de chips, la detección de señales requiere instrumentos y equipos especiales, y los laboratorios generales no pueden permitirse el alto costo. En segundo lugar, todavía quedan muchos aspectos de la tecnología experimental de chips que deben mejorarse. Por ejemplo, en la síntesis de sondas, el foco de la investigación es cómo mejorar aún más la eficiencia de la síntesis y la integración de chips. La simplificación y estandarización de la preparación de muestras son requisitos previos para una mayor popularización de las aplicaciones de chips. Aunque la tecnología de chips todavía tiene algunos problemas, se ha utilizado ampliamente en campos como la elaboración de perfiles de expresión genética, el diagnóstico genético, la detección de fármacos y el análisis de secuencias
Perspectivas de aplicación: con la profundización de la investigación y la mejora de la tecnología, Los chips genéticos seguramente desempeñarán un papel cada vez más importante en el campo de la investigación en ciencias biológicas.
Pomerización in situ: Los materiales nanocompuestos se han convertido en el foco del futuro desarrollo de envases flexibles, y por ello han recibido cada vez más atención. El mercado mundial de nanomateriales se está expandiendo a medida que la tecnología produce materiales con propiedades mecánicas y de barrera mejoradas y un peso más liviano. Se espera que el mercado mundial de la nanotecnología crezca hasta alcanzar los 250 millones de dólares EE.UU. en 2008, con una tasa de crecimiento anual del 18% al 25%.
Los materiales nanocompuestos se han convertido en el foco del futuro desarrollo de envases flexibles y, por tanto, reciben cada vez más atención. El mercado mundial de nanomateriales se está expandiendo a medida que la tecnología produce materiales con propiedades mecánicas y de barrera mejoradas y un peso más liviano. Se espera que el mercado mundial de la nanotecnología crezca hasta alcanzar los 250 millones de dólares EE.UU. en 2008, con una tasa de crecimiento anual del 18% al 25%.
Composición de nanomateriales
Los nanocompuestos poliméricos se construyen dispersando rellenos entre nanopartículas para formar plaquetas.
Estos pequeños cristales luego se dispersan en la matriz del polímero, formando varias capas paralelas que obligan a los gases a escapar del polímero a través de "canales tortuosos", creando una barrera compleja para el gas y el vapor de agua. Cuanto más tortuosa sea la estructura del polímero, mayores serán las propiedades de barrera. El coeficiente de permeabilidad (P) de una membrana polimérica está determinado por dos factores: coeficiente de difusión (D) y solubilidad (S), es decir, P = DxS.
La permeabilidad también disminuye significativamente cuando se dispersan más nanopartículas en el polímero. Según una investigación del Centro de Investigación de Soldados Natick del Ejército de EE. UU., "Cuando las membranas nanocompuestas se combinan con membranas de polímero puro, el grado de dispersión de las nanopartículas en el polímero se asocia con mejoras en las propiedades mecánicas y de barrera".
Para obtener el mejor rendimiento de la película, se utilizan muchas menos nanopartículas que los rellenos tradicionales. Por lo general, la dosis de nanorellenos es inferior al 5%, lo que puede reducir en gran medida el peso de las membranas nanocompuestas. El proceso de dispersión de nanopartículas da como resultado una alta relación de aspecto y una alta área superficial del material, lo que hace que los plásticos rellenos de nanopartículas funcionen mucho mejor que los plásticos rellenos de material convencional.
Tipos de embalaje
Existen diferentes tipos de rellenos para elegir. El más común es un material de nanoarcilla llamado caolín, una capa de arcilla montmorillonita. La arcilla es hidrófila en su estado natural, mientras que los polímeros son hidrófilos. Para armonizar los dos, se debe aumentar la polaridad de la arcilla, convirtiéndola en una sustancia más "orgánica". Una forma de modificar las arcillas es intercambiar cationes de amonio orgánicos (iones cargados positivamente) con cationes inorgánicos en la superficie de la arcilla.
Otros nanorellenos incluyen nanotubos de carbono, grafito en escamas y nanofibras de carbono. También se están investigando algunos rellenos, como la arcilla sintética, las fibras naturales (cáñamo, lino) y el POSS (película fotoeléctrica nanocompuesta). Los nanotubos de carbono tienen un coeficiente de expansión más alto que los rellenos de nanoarcilla que se encuentran fácilmente disponibles en la naturaleza, lo que proporciona una excelente conductividad eléctrica y térmica. Los dos principales proveedores de nanoarcilla son Southern Clay Products Company (www.nanocor.com) y Nanocor Corporation (www.nanocor.com).
Tres métodos de relleno
Generalmente existen tres métodos para preparar nanocompuestos mejorando las propiedades de los polímeros con nanorellenos: amasado en fusión, polimerización in situ y disolución. El amasado por fusión o el procesamiento para llenar el polímero con el nanorelleno pueden ocurrir mientras el polímero se fabrica mediante una extrusora, una máquina de moldeo por inyección u otro equipo de procesamiento. Usando cizalla, las partículas de polímero y el relleno (arcilla) se presionan juntas para ayudar a la exfoliación (un tratamiento que rompe las partículas en la forma y estructura de capas correctas) o dispersión. La polimerización in situ consiste en agregar cargas directamente a los monómeros líquidos en el estado de polimerización. El método de disolución utiliza tolueno, cloroformo, acetonitrilo y otros solventes para agregar cargas a la solución de polímero para combinar las moléculas del polímero y la carga.
Debido a que los disolventes son perjudiciales para el medio ambiente, el amasado por fusión y la polimerización in situ son los métodos más utilizados para producir nanocompuestos.
Por lo tanto, el método de polimerización in situ añade el relleno directamente al monómero líquido en estado polimerizado.