Experimentos en el cultivo de subculturas
Fármacos: medio de cultivo (RPMI1640 o DMEM), suero de ternera o suero fetal de ternera, tripsina al 0,25%, solución de Hank.
Instrumento: ¿CO? Incubadora, microscopio invertido, mesa limpia. 1. Lávese las manos con jabón y desinféctelas con alcohol al 75% antes de ingresar a la sala esterilizada.
2. Observe la morfología celular bajo un microscopio invertido para determinar si es necesario pasar las células y el factor de dilución celular. Precalentar el medio de cultivo a 37°C.
3. La superficie del banco ultralimpio debe estar limpia y limpia con una solución nueva de cloruro de benzalconio al 0,1%.
4. Encienda la lámpara ultravioleta del banco ultralimpio para iluminar la mesa durante unos 20 minutos, apague la lámpara ultravioleta del banco ultralimpio y encienda el extractor de aire para purificar el aire y eliminar el ozono.
5. Encienda la lámpara de alcohol; saque el tubo de ensayo estéril, la pipeta Pasteur y la pipeta de calibración; instale el cabezal de goma; después de que la llama de la lámpara de alcohol arda ligeramente, inserte el tubo de ensayo estéril.
6. Desinfectar la boca del frasco de la solución de cultivo con alcohol al 75%, pasarlo por la llama de la lámpara de alcohol y colocarlo en el estante al lado de la lámpara de alcohol.
7. Vierta el medio antiguo utilizado para cultivar las células. Dependiendo de la situación, se pueden usar 2-3 ml de solución de Hanks para eliminar el medio de cultivo antiguo restante o se puede usar una pequeña cantidad de tripsina para enjuagar.
8. Añade 1 ml de tripsina a cada frasco de cultivo grande y reduce la cantidad si corresponde para frascos pequeños. Después de cerrar la tapa de la botella, observe bajo un microscopio invertido. Cuando las células se vuelven redondas, invierta inmediatamente el matraz de cultivo para liberar las células de la tripsina y luego deseche la tripsina. Tenga cuidado de no arrojar células a los jugos digestivos prematuramente.
9. Agregue una pequeña cantidad de medio de cultivo fresco que contenga suero, sople aire repetidamente para que las células digeridas se caigan y se dispersen, luego agregue una cierta cantidad de medio de cultivo fresco que contenga suero (7 ~ 10 ml/botella). , 3 ~ 5 ml/frasco) para preparar una suspensión celular y luego dispensarla en nuevos frascos de cultivo. Coloque la tapa en la botella, apriétela moderadamente y luego gírela suavemente para facilitar el CO? Después de que entre el gas, ¿devolver la botella de cultivo a CO? incubadora.
10. Para las células cultivadas en suspensión, no se requieren los pasos 7-9. La suspensión celular se puede centrifugar para eliminar el sobrenadante del medio antiguo y se puede agregar medio nuevo y colocarlo en botellas.
Cosas a tener en cuenta
1. Preste atención al funcionamiento aséptico para evitar la contaminación cruzada entre las células durante el paso. Todas las operaciones deben realizarse lo más cerca posible de la llama del quemador de alcohol. Lo mejor es realizar sólo una operación unitaria a la vez. Se utiliza un conjunto de equipos por celda. El medio de cultivo debe estar estrictamente separado.
2. Observe la morfología celular todos los días y comprenda el estándar de si las células están sanas: las células sanas tienen una forma regordeta, un buen índice de refracción y pueden transmitirse cuando crecen intensamente.
3. Si se descubre que las células están contaminadas, se deben tomar medidas inmediatamente. En general, las células contaminadas deben desecharse. Si es necesario el almacenamiento, se puede agregar BSS o medio de cultivo que contenga antibióticos para una limpieza repetida, y luego se puede agregar una gran cantidad de antibióticos al medio de cultivo, y el medio de cultivo debe reemplazarse con frecuencia.