¿Qué debo hacer si la tinción inmunohistoquímica es normal?
1 Primero, descarte si el antígeno en la sección del tejido se pierde y cuánto se pierde. Los dos factores más importantes en inmunohistoquímica son los antígenos y los anticuerpos. (1) La pérdida de antígeno depende principalmente de la frescura de las secciones de tejido. Generalmente, si las rodajas se almacenan a temperatura ambiente durante más de 3 a 6 meses, los antígenos de las rodajas pueden perderse gravemente (lo que respalda la literatura). En este momento, se puede realizar una verificación adicional reutilizando secciones de parafina (los bloques de parafina deben almacenarse a baja temperatura). (2) Durante la preparación de secciones de parafina, los grupos aldehído pueden bloquear los determinantes antigénicos, que deben exponerse completamente mediante la reparación del antígeno para aumentar la reacción de unión antígeno-anticuerpo y mejorar la tasa de positividad. Por lo general, uso la recuperación de antígenos en microondas a temperatura media y el tampón de citrato de sodio durante 6 minutos * 4 veces. (3) ¿Cuál es el contenido de antígeno en las secciones de tejido? He aprendido una lección en este sentido. Hice la identificación de células de Leydig en testículos de ratones fetales y el anticuerpo primario a 1:200 funciona muy bien; pero usé el anticuerpo primario a 1:200 para incubar células de Leydig en testículos de adultos y fue casi negativo. Más tarde, se confirmó que el contenido de antígeno de los dos era muy diferente y que la concentración de anticuerpos primarios debía aumentarse adecuadamente.
2. En segundo lugar, compruebe si el anticuerpo está seleccionado correctamente y si las condiciones de incubación del anticuerpo son incómodas. El (1) anticuerpo monoclonal seleccionado como anticuerpo primario tiene baja sensibilidad pero buena especificidad y es propenso a resultados negativos no detectar el tipo de tejido en la clasificación de la reactividad del anticuerpo primario es un error común cuando el primer anticuerpo selecciona ratas; El segundo resultado negativo puede ocurrir cuando el anticuerpo secundario es anti-ratón/conejo. (2) El tiempo de incubación de los anticuerpos es demasiado corto, lo que fácilmente puede provocar resultados negativos. En términos generales, recomiendo 4 incubaciones durante la noche y recalentar a 37 grados durante 45 minutos; el segundo anticuerpo suele ser a 37 grados durante 30 minutos; No me gusta leer las instrucciones del kit de tinción de anticuerpos secundarios. (3) La concentración de anticuerpos es demasiado baja. Ésta es la razón más probable de los resultados negativos. Se debe aumentar la dilución. Suele ser la primera vez que hago un nuevo anticuerpo. Me gusta hacerlo una vez con las concentraciones altas y bajas sugeridas en las instrucciones, y luego decidir si explorar más o menos. Generalmente, primero se determina la concentración del anticuerpo secundario (la solución de trabajo es fácil de manejar y se puede agregar gota a gota directamente) y se explora principalmente la concentración óptima del anticuerpo primario. Nota: Existen efectos previos y posteriores a las bandas en la respuesta inmune, lo que indica que cuanto mayor es la concentración, mayor es la tasa positiva y viceversa. (4) Una vez eliminadas las razones importantes, no ignore la calidad del anticuerpo: el anticuerpo original es generalmente estable y el embalaje importado es eficaz; es posible que sea necesario prestar atención a los problemas de calidad en la solución de trabajo;
3. Al mismo tiempo, es posible que sea necesario ampliar adecuadamente el tiempo de incubación de DAB y, en ocasiones, se puede ampliar hasta 30 minutos bajo un microscopio. Pero normalmente tarda entre 3 y 10 minutos y el fondo es relativamente claro. De lo contrario, la concentración de anticuerpos será inadecuada.
4. Finalmente, el tiempo de bloqueo del suero también se puede acortar en consecuencia. Generalmente es de 10 a 30 minutos, pero este tiempo se puede ajustar. El objetivo principal de sellar el portaobjetos es reducir la coloración general del fondo del corte.
5. Además, no se puede ignorar la permeabilidad celular. Muchos camaradas creen que los cortes en parafina generalmente no requieren permeabilización celular porque las células pueden haber sido seccionadas durante el corte. Sin embargo, para las proteínas nucleares, se recomienda la permeabilidad para promover la participación completa de los anticuerpos y otros reactivos en la reacción.
6. Todas las razones anteriores se analizan por razones comunes en la práctica. La premisa es eliminar los resultados negativos causados por los errores operativos del operador. Esto requiere que los principiantes establezcan controles positivos para eliminar los problemas del método. Hay otras razones, como el bajo valor de pH del diluyente del anticuerpo.