¿Qué es el ensayo de inhibición enzimática?
1. Método de inhibición de la colinesterasa (ChE)
Los pesticidas organofosforados y carbamatos pueden inhibir la actividad de la AChE en los organismos. En consecuencia, al utilizar la interacción entre la AChE in vitro y los pesticidas residuales en los alimentos, la AChE se inhibe en diferentes grados y el sustrato se hidroliza mediante enzimas en diferentes cantidades, lo que da como resultado un color más claro o ningún desarrollo de color, y se calculan los residuos de pesticidas. respectivamente. Las fuentes de enzimas comúnmente utilizadas incluyen esterasa hepática de ganado vacuno, porcino y otros animales, plasma o suero humano, suero de caballo, esterasa cerebral de moscas o cabezas de abeja, carboxilesterasa de conejo o ratón, etc. Los métodos de prueba diseñados en base a este principio son principalmente el método colorimétrico de enzimas líquidas y la tarjeta de prueba rápida en papel.
(1) Colorimetría de líquidos enzimáticos. La AChE se extrajo de las cabezas de cepas sensibles de mosca doméstica y se hizo reaccionar con una serie de concentraciones de paratión en condiciones controladas artificialmente, utilizando tiouro de acetilcolina (ATCT) como sustrato y ácido 5,5-ditio-2,2-dinitrobenzoico como sustrato. un revelador de color y la colorimetría se realiza en luz visible con una longitud de onda de 410 nm después de un cierto período de tiempo. Con base en el valor de absorbancia, calcule el grado de inhibición de la AChE y use un tubo de ensayo sin enzima como control en blanco. El porcentaje de actividad enzimática se calcula según la siguiente fórmula.
Como reacción enzimática in vitro en un tubo de ensayo, se deben controlar estrictamente condiciones como la temperatura de reacción, el tiempo óptimo de reacción, la concentración de enzima y sustrato de la reacción y el pH del entorno circundante.
(2) Método de tarjeta de prueba de velocidad. La tarjeta de prueba rápida de residuos de pesticidas es una tira de papel rectangular de 55 mm y 2 mm, con una tableta redonda blanca y otra roja con un diámetro de 15 mm unidas simétricamente. La tableta blanca contiene colinesterasa extraída del suero bovino y la tableta roja contiene el análogo de acetilcolina 2,6-dicloroindofenol (azul) y ácido acético. Si hay presentes pesticidas organofosforados o carbamatos, la actividad de la colinesterasa se inhibirá sin reacción de hidrólisis y no se producirá ninguna sustancia azul. Durante la prueba, primero deje caer 2 gotas de eluyente (tampón fosfato pH 7,5) sobre las hojas de vegetales, frote suavemente el área de la gota con una tableta blanca y déjela durante 10 minutos para la reacción previa. Doble la tarjeta de prueba rápida hacia adentro y pellizca. con los dedos, contacte estrechamente las tabletas blancas con las tabletas rojas durante 3 minutos. Abra la tarjeta de prueba rápida. Si la tableta blanca se vuelve azul, es negativa. Si no cambia de color, indica la presencia de pesticidas organofosforados y carbamatos. .
La ventaja del método de inhibición de la colinesterasa es que puede detectar de forma rápida y sensible variedades de pesticidas que inhiben la colinesterasa. Tiene un pretratamiento simple y un tiempo de detección corto (el método colorimétrico enzimático líquido es adecuado. para medición in situ. La desventaja es que las enzimas, sustratos y reactivos cromogénicos utilizados tienen ciertas especificidades y hay muchas condiciones que deben controlarse. Además, la contaminación causada por otros tipos de pesticidas no se puede detectar y la sensibilidad a ciertos pesticidas de tiofosfato (como el euxafos) no es alta. La contaminación causada por estos pesticidas puede pasar desapercibida o detectarse erróneamente. Por lo tanto, si la tecnología de inhibición de la colinesterasa se combina con bioensayos, se pueden detectar vegetales supertóxicos a partir de numerosas muestras de vegetales en poco tiempo y se puede distinguir la contaminación causada por piretroides, pesticidas organofosforados y carbamatos.
2. Método de inhibición de la esterasa vegetal (fitoesterasa)
El principio de este método es utilizar hidrolasa vegetal para hidrolizar el 2,6-dicloroacetil indofenol y utilizar ojos o instrumentos para identificar el cambio de color de la solución de reacción antes y después. hidrólisis. El grado de inhibición enzimática por pesticidas. En presencia de pesticidas organofosforados o carbamatos, la actividad de las hidrolasas vegetales se inhibe y el color azul del indofenol se vuelve más claro. El método de enzimas vegetales no requiere el uso de solventes orgánicos durante el proceso de medición. El método de pretratamiento es simple, la velocidad de medición es rápida y el costo es bajo, por lo que también tiene cierto valor de aplicación.
3． Método de la hidrolasa organofosforada (OPH)
La hidrolasa organofosforada es una esterasa codificada por el gen de la enzima degradante de organofosforado (opd) que existe ampliamente en una variedad de organismos. La hidrolasa organofosforada presente en los microorganismos puede romper los enlaces fosfato (enlaces P-O y P-S) de los compuestos organofosforados para desintoxicar los compuestos organofosforados. Por ejemplo, Wang Yinshan aisló una cepa, Pseudomonas Ws-5, que tiene una gran capacidad para degradar el metamidofos. Por lo tanto, el OPH se utiliza principalmente para la destrucción de armas químicas y algunos pesticidas organofosforados caducados, la protección y descontaminación de personas y objetos expuestos a venenos y el tratamiento de personas envenenadas. El OPH se fija en la superficie del electrodo para crear un biosensor que puede detectar rápidamente residuos de pesticidas organofosforados en el sitio. OPH hidroliza compuestos organofosforados con reacción específica y eficiente (la eficiencia de la hidrólisis enzimática es de 40 a 2450 veces mayor que la de la hidrólisis química), condiciones de reacción suaves, sin irritación, fácil almacenamiento de la enzima curada, dosis pequeña y bajo costo, y tiene buena aplicaciones.