¿Qué es la clonación posicional? Gracias
El Proyecto Genoma Humano ha identificado una serie de marcadores moleculares distribuidos en los 24 cromosomas de todo el genoma. Con base en la información de secuencia y posición de estos marcadores moleculares, combinados con hibridación o PCR, se pueden detectar rápidamente puntos calientes en los cromosomas relacionados con tumores o enfermedades genéticas, y luego se pueden clonar genes relacionados con enfermedades a partir de ellos. La clonación posicional candidata supera las engorrosas y lentas desventajas de la clonación posicional clásica que sólo se basa en el análisis de ligamiento para localizar cromosomas, y acelera enormemente el proceso de clonación. Y no se limita a enfermedades genéticas, sino que ahora se utiliza más en la clonación de genes de susceptibilidad a tumores. El mapa genético construido internacionalmente en 1994 y publicado por primera vez en 1996 es una combinación de un mapa físico STS (sitio de etiqueta de secuencia) basado en ADNc y un mapa genético de marcadores de microsatélites polimórficos. Por un lado, hace que el posicionamiento de los cromosomas sea más exacto, fiable y preciso. Al mismo tiempo, proporciona una gran comodidad para obtener genes candidatos relacionados con enfermedades de regiones candidatas, simplificando y acelerando la clonación de genes diana e inyectando mayor vitalidad al desarrollo y aplicación de este método, que se manifiesta en 16 nuevas enfermedades relacionadas. Los genes se han clonado uno tras otro, como el gen supresor de tumores DPC4 aislado del cáncer de páncreas 1998 65438 En octubre, GeneBank publicó el último "Gene Map 98", que contiene más información y la exactitud y precisión se han mejorado enormemente. . Contiene 41.464 marcadores STS, que representan la información de ubicación de 30.181 genes, lo que significa que todo el genoma humano tiene aproximadamente 60.000. En resumen, con el avance del Proyecto Genoma Humano, el posicionamiento de clones candidatos se ha convertido en un método eficaz para clonar genes relacionados con enfermedades.
La localización de clones candidatos incluye tres pasos básicos: mapeo del genoma, adquisición de ADNc candidato y análisis funcional y de longitud completa. Este artículo describe el desarrollo y aplicación de esta estrategia.
1. Mapeo del genoma
Un método común recientemente desarrollado, especialmente para aislar genes de susceptibilidad a tumores, es detectar la pérdida de heterocigosidad en múltiples muestras mediante PCR (LOH) o regiones de alta frecuencia. de deleción homocigótica para obtener la ubicación de genes candidatos a enfermedades [3]. La inactivación de genes supresores de tumores somáticos es un factor importante que conduce a la carcinogénesis y la manifestación más común es la pérdida de heterocigosidad. Normalmente hay uno o más genes supresores de tumores en las regiones cromosómicas con alta frecuencia de pérdida de heterocigosidad. Utilizando marcadores moleculares (incluidos STS, marcadores de microsatélites, etc.) dispersos en cada cromosoma, la PCR se puede utilizar para detectar la eliminación de bandas cromosómicas en múltiples muestras de tumores, determinando así las áreas de alta frecuencia de LOH, es decir, determinando el resultado negativo. efectos del crecimiento tumoral. La ubicación cromosómica de los factores reguladores puede ser precisa en la región indicada por los marcadores moleculares del genoma, que pueden usarse posteriormente para la clonación de genes. Se han clonado con éxito varios genes supresores de tumores mediante este método, como BRCA1, BRCA2 en el cáncer de mama y el gen DPC4 en el cáncer de páncreas. Al mismo tiempo, con el continuo desarrollo y popularización de la tecnología FISH y la madurez de la tecnología de microdisección cromosómica, se pueden cortar bandas cromosómicas específicas bajo el microscopio, se pueden preparar sondas específicas de bandas cromosómicas y se pueden analizar tejidos normales y patológicos. FISH, y la determinación se puede determinar mediante comparación. ubicaciones de bandas cromosómicas de genes relacionados con enfermedades. En los últimos años, el establecimiento de mapas de hibridación por radiación ha permitido localizar con precisión los cromosomas. Estos métodos son más rápidos y precisos que el análisis de vinculación original. Por ejemplo, a L-C Cui le llevó unos 10 años localizar el gen de la fibrosis quística en el cromosoma 7 mediante un análisis de ligamiento, pero ahora puede llevar un año o menos completar el trabajo.
2. Cribado del ADNc candidato
La información proporcionada por el mapeo del genoma contiene ciertos marcadores moleculares, que pueden obtenerse directamente de la biblioteca YAC (Annual Artificial Chromosome), BAC (los clones correspondientes). se seleccionaron de la biblioteca de cromosomas artificiales bacterianos) y de la biblioteca de PAC (cromosoma artificial P1). Las bibliotecas YAC tienen serios quimerismos y son difíciles de operar, y han sido reemplazadas gradualmente por bibliotecas PAC y BAC. El sistema PAC es un sistema de clonación basado en el fago P1, que puede acomodar insertos de 70 a 100 kb, puede distinguir selectivamente recombinantes de no recombinantes y tiene dos conjuntos de mecanismos de replicación. Se pueden usar replicones de copia única para una proliferación clonal estable, mientras que se pueden usar replicones de copia múltiple para preparar ADN controlado por el operón Lac [4]. El sistema BAC es un sistema de vector derivado del factor F estable en E. coli y puede acomodar inserciones que superen los 100 kb. La longitud promedio de inserción de los clones BAC es de 120 kb y la longitud máxima puede alcanzar aproximadamente 240 kb [5]. Buena estabilidad y funcionamiento sencillo son las principales ventajas del sistema BAC. A partir de estos clones, los ADNc candidatos se obtienen mediante métodos que se basan en bibliotecas de ADNc, secuencias distintivas o propiedades de expresión apropiadas.
(1) Hay dos métodos que se basan en bibliotecas de ADNc apropiadas: cribado directo y selección de ADNc. El método de detección directa utiliza ADN genómico para detectar directamente el ADNc ubicado en fragmentos genómicos de bibliotecas de ADNc, como aislar fragmentos exógenos de clones YAC [6], PAC [7] y BAC que cubren la región candidata y usarlos como sondas para detectar la región candidata. biblioteca.gen candidato; el método de selección de ADNc [8] es todo lo contrario del método de detección directa. El ADN genómico se fija en una membrana, se hibrida con el ADNc total y los fragmentos de ADNc que pueden unirse a los fragmentos genómicos se recuperan mediante PCR. La ventaja del método de detección directa es que evita la operación de subclonación de grandes fragmentos de la región candidata y puede obtener información sobre múltiples transcripciones en una sola detección. Sin embargo, la desventaja es que es difícil purificar fragmentos grandes. La ventaja relativamente conveniente de purificar fragmentos de clones de PAC y BAC se ha convertido en la tendencia de desarrollo de este método. Al mismo tiempo, debido a la complejidad de la sonda, el fondo de hibridación se profundiza, aumentan los falsos positivos y los exones cortos o el ADNc de baja abundancia se pasan por alto fácilmente. La mayor ventaja del método de selección de ADNc es que la intervención en la reacción de PCR mejora en gran medida la sensibilidad de la selección y puede detectar algunas transcripciones raras.
(2) Los métodos que se basan en secuencias características consisten en aislar directamente fragmentos de ADNc del ADN genómico en función de las características de la secuencia dentro y en ambos lados de la transcripción. Incluyen principalmente el método de búsqueda de islas CpG y el método de captura de exones. y método de comparación de homología de secuencia de especies trans, método de PCR Alu y método de análisis de secuencia directa. Las Islas CpG, también conocidas como Islas HTF, son pequeñas áreas ricas en gas natural. La mayoría de las transcripciones contienen islas CpG no metiladas cercanas (generalmente en la región 5' aguas arriba) [9]. Utilice algunas enzimas raras que reconocen islas CpG, como Sac, BssH, Eag, etc. Se corta el ADN genómico y se obtienen secuencias ubicadas cerca de las islas CpG como sondas para obtener transcripciones de bibliotecas de ARN total o ADNc. El método de captura de exones se basa en identificar sitios de empalme funcionales 5' y 3' en ambos lados del exón y aislar fragmentos de exón del ADN genómico. La base para la comparación de la homología de secuencia entre especies es que las secuencias de la región codificante están mucho más conservadas entre diferentes especies que las regiones no codificantes [11]. El ADN de la región candidata se divide en varios subclones, que se hibridan con el ADN total. de diferentes especies y mezclados con diferentes especies. Los clones de ADN con señales de ADN de especies positivas pueden ser genes de regiones codificantes. Este enfoque se basa en la homología de secuencia a nivel de ADN entre especies. Las secuencias Alu son secuencias cortas y repetitivas repartidas por todo el genoma humano. Al diseñar secuencias Alu específicas para humanos como cebadores, se pueden obtener rápida y directamente secuencias específicas para humanos a partir de clones YAC, BAC, PAC o células híbridas humano-ratón mediante PCR [12]. La regla del análisis de secuencia directa es utilizar GRAIL, GeneScan [13] y otro software para analizar e inferir los genes codificantes en la información de la secuencia del genoma.
(3) Método dependiente de la expresión, concretamente análisis de hibridación Northern [14].
El ADN genómico de la región candidata se utiliza como sonda para hibridar con el ARN total, y la banda positiva se corta, se transcribe inversamente en ADNc y se clona para obtener el transcrito ubicado en el fragmento genómico.
Cada uno de los métodos anteriores tiene sus propios pros y contras. Es necesario seleccionar una combinación adecuada de uno o más métodos para lograr el propósito de la investigación en función de las materias primas utilizadas y el propósito que se desea lograr. Además, existen muchos otros métodos, como la microdisección y la microclonación, la hibridación sustractiva de ADNc, el cribado recombinante, etc.
3. Análisis funcional y de longitud completa
Después de obtener una gran cantidad de cdna candidato, clone el gen de longitud completa mediante la detección de la biblioteca de cdna o RACE. Para identificar los genes causantes, es necesario detectar uno por uno sus cambios en las familias afectadas y analizar sus funciones. El análisis funcional suele ser difícil para la clonación posicional porque diferentes enfermedades tienen características diferentes y, por lo tanto, requieren diferentes sistemas de detección funcional para el análisis. Los métodos comúnmente utilizados incluyen el estudio de cambios en la morfología y función celular después de la expresión de genes sentidos o antisentido a nivel celular, la detección de cambios en la morfología celular y la inhibición por contacto en la investigación de tumores, cambios en la capacidad de crecimiento en agar blando y análisis de tumorigenicidad en ratones desnudos. . Un análisis funcional adicional incluyó experimentos de eliminación de genes a nivel individual.
Se han desarrollado algunas ideas nuevas que se combinan con otros métodos, como la combinación con hibridación sustractiva para detectar genes expresados diferencialmente en regiones candidatas, lo que mejora enormemente la posibilidad de obtener genes valiosos. Al mismo tiempo, con el desarrollo de mapas transcripcionales [15] en el proyecto del genoma humano, muchas tecnologías ecológicamente racionales se han localizado con precisión en diferentes bandas de cromosomas y pueden utilizarse directamente para estudios funcionales. Con la profundización de la investigación, se completan cada vez más mapas EST y los mapas de transcripción genética se mejoran continuamente. Podemos omitir directamente el segundo paso de la clonación posicional y realizar directamente la identificación funcional y la clonación genética completa. paso en la clonación posicional La forma más rápida. Hoy en día, con la mejora continua de los métodos de análisis y aislamiento y la implementación en profundidad del Proyecto Genoma Humano, están surgiendo una tras otra varias ideas y métodos nuevos, y el tiempo del ciclo de los métodos de posicionamiento y clonación también se acortará, lo que proporciona la posibilidad de que los humanos eventualmente clonen diversos genes de enfermedades.