¿Cuál es el papel de la referencia interna RT-PCR? Cómo elegir genes de limpieza
Deberíamos hablar de PCR en tiempo real. Tenga en cuenta que RT es en realidad la abreviatura de transcripción inversa y debe separarse de tiempo real.
Las qPCR y qRT-PCR comúnmente mencionadas se basan en métodos en tiempo real para medir el valor ct inicial de una determinada plantilla en la muestra.
Sin embargo, debido a pasos previos como La extracción y la inversión de ARN tenían eficiencias diferentes y el valor de ct no podía reflejar verdaderamente la cantidad absoluta de plantilla en la muestra. Por lo tanto, se necesitaba una referencia interna como referencia.
Por ejemplo, el valor ct del gen A es 18 en la muestra a y 20 en la muestra b. Debido a una serie de diferencias en la calidad del ARN de las muestras a y b, no se puede juzgar directamente si este gen. es El nivel de expresión en la muestra a es 4 veces mayor que el de la muestra b.
En este momento, necesitamos una referencia interna si el valor ct de la referencia interna es 14 en la muestra a y 15 en la muestra b. Debido a la estabilidad de la referencia interna, se considera que el nivel de expresión es consistente en diferentes muestras. Por lo tanto, el valor -ΔΔct del gen A entre muestras ab es 1, lo que significa que el nivel de expresión es 2 veces.
Aquí podemos conocer el papel de la referencia interna, es decir, midiendo la referencia interna, se pueden homogeneizar las cantidades iniciales de diferentes muestras en el proceso de análisis posterior. La referencia interna necesita seleccionar genes con niveles de expresión estables en diferentes muestras, razón por la cual los genes de mantenimiento a menudo se seleccionan como controles internos. Tomando como ejemplo los ratones, las referencias internas de uso común incluyen actin gapdh hprt, etc.
Por supuesto, muchas opiniones actuales creen que la abundancia de estos genes es diferente en diferentes tejidos. Por ejemplo, gapdh tiene una gran abundancia en tejidos con alto contenido mitocondrial. Mucha gente cree que se utiliza el ADN genómico como método. La referencia interna será más confiable. Spectrum, por supuesto, es una historia más adelante. Elegir gapdh no obstaculizará el experimento actual. Si cree que no es confiable, puede elegir dos referencias internas.
Para la especie que estás estudiando, alguien debería haber publicado la referencia interna correspondiente. Basta con buscarla directamente en la base de datos.
Contenido original, difícil de codificar, espero que lo adoptes.