Pasos experimentales para la tecnología de preparación de muestras microscópicas
1. Método sin rebanar
Es decir, un método de hacer rebanadas sin rebanador y sin procedimientos de corte. Existen diferentes métodos de procesamiento según las diferentes propiedades del material. Este tipo de método La operación es simple y rápida. Entre ellos, el método de extensión y el método de sellado pueden evitar que se destruya la estructura del tejido original. El método de frotis y el método de prensado compensan las deficiencias de los métodos de inclusión y sección. No se pueden observar claramente, por lo que son muestras microscópicas. métodos comúnmente utilizados en la producción.
1.1 Método de frotis
Se utiliza principalmente para sangre, semen, orina, esputo, microorganismos y otros materiales granulares líquidos que no se pueden cortar en rodajas finas. Luego se fija una sola capa de células en un portaobjetos de vidrio, se deshidrata, se tiñe y se convierte en una muestra permanente.
1.2 Método de difusión
Se utiliza principalmente para observar la capa epidérmica de tejidos animales y vegetales. Los tejidos animales y vegetales a observar se pueden tomar vivos y una capa de epidermis. Se puede despegar con unas pinzas afiladas y extender rápidamente sobre un portaobjetos de vidrio. Como por ejemplo la preparación de células epidérmicas de cebolla.
1.3 Método de prensado
Algunos materiales tiernos y blandos se pueden colocar sobre un portaobjetos de vidrio, dispersarlos con un bisturí pequeño, añadir una gota de tinte y cubrir. Apriete el portaobjetos verticalmente con la mano. pulgar para extender el tejido en una rebanada delgada y luego observarlo, como observar los cromosomas en la punta de la raíz de la planta, observar las etapas de desarrollo de los granos de polen, etc.
1.4 Método de aislamiento
Este método utiliza reactivos químicos para disolver la matriz intercelular del tejido de modo que las células puedan dispersarse en individuos individuales. Después del teñido, deshidratación y transparencia, se puede observar su forma individual, siendo apto para músculos, hojas, tallos y otras partes.
Discos de desbaste de 1,5
Se utilizan para tejidos muy duros, como huesos y dientes.
2. Método de corte
El método de corte es un método que debe depender de las manos o de un microtomo para cortar el tejido en rodajas finas para su observación. Para observar claramente la estructura del tejido y la morfología celular de animales y plantas, primero se deben infiltrar ciertas sustancias de soporte en los tejidos a través de una serie de pasos para endurecerlos y poder cortarlos en rodajas finas según el tipo de. agente de soporte utilizado. Se divide en método de corte a mano alzada, método de corte con parafina, método de corte con colodión, método de corte congelado, etc. Después de cortar en secciones delgadas, se requieren pasos como la eliminación de cera, el teñido, la deshidratación y la transparencia para convertirlas en ejemplares permanentes.
A continuación se utilizan secciones de parafina como ejemplo para presentar el método de preparación de muestras microscópicas.
2.1 Selección de materiales
Seleccione los materiales correspondientes según los diferentes propósitos experimentales. Los materiales deben ser frescos, precisos y completos, y los materiales deben evitar extrusión, magulladuras y sequedad. Los materiales recolectados deben colocarse inmediatamente en el fijador y numerarse, indicando la hora de recolección, la ubicación, el nombre y el sitio del tejido. El bloque de tejido debe ser del tamaño apropiado, lo que no solo debe explicar el problema, sino también considerar la capacidad de penetración del mismo. el fijador. Generalmente, los materiales tomados para histología son un poco más grandes, los materiales tomados para citología son un poco más pequeños, los materiales tomados para tejidos vegetales son un poco más pequeños y los materiales tomados para tejidos animales son un poco más grandes.
2.1.1 Anestesia y matanza de animales
Recolectar materiales de animales vivos no es tan fácil como recolectar materiales vegetales, porque sin aplicar anestesia, algunos animales se encogerán (como las lombrices y sanguijuelas), y algunas se removerán (como las ranas y las ratas), haciéndonos imposible hacer nada. Sin embargo, los materiales necesarios para la producción deben ser lo más frescos posible. En particular, la investigación citológica tiene requisitos más estrictos en cuanto a la frescura de los materiales. Por lo tanto, para cortar tejidos animales vivos, en circunstancias normales, se debe anestesiar al animal y luego se deben cortar y fijar los materiales. Sin embargo, los fármacos anestésicos utilizados deben basarse en el principio de no afectar la estructura celular.
Si se trata de una película histológica general y los requisitos no son demasiado estrictos, se puede sacrificar primero al animal y luego retirar rápidamente el tejido para su fijación. Los animales más pequeños, como ranas, sapos, ratas, etc., pueden morir por decapitación, es decir, cortándoles el cuello con unas tijeras normales. A los animales más grandes, como cobayas, conejos, gatos, etc., se les puede golpear en la parte posterior de la cabeza con un mazo de madera para desmayarlos, o se les puede inyectar aire desde la vena de la oreja hasta el corazón con una jeringa de 50 ml. provocar que el animal sufra embolia gaseosa aguda y muerte.
Si los animales antes mencionados necesitan ser anestesiados para recolectar materiales, se pueden sumergir bolas de algodón absorbente en cloroformo o éter y colocarlas en la punta de la nariz del animal para anestesiarlos mediante inhalación. Los animales grandes (perros, monos, etc.) deben anestesiarse por vía intravenosa con uretano. La dosis es generalmente de 1 gramo por kilogramo de peso corporal del animal.
Los animales anestesiados también necesitan ser sangrados y luego reparados.
Los insectos y otros animales pequeños se pueden introducir en una botella de boca grande llena de cloroformo o vapor de éter para anestesiarlos. Para matarlo, colóquelo en una botella de veneno que contenga cianuro de potasio.
2.1.2 Corte de bloques de tejido animal
Al cortar bloques de tejido animal, es necesario prestar atención a los siguientes puntos:
Primero, considere el El material debe incluir las estructuras importantes o todas las estructuras de cada órgano. Por ejemplo, el tubo digestivo debe incluir la estructura de cuatro capas de mucosa, submucosa, muscular y adventicia. Si el órgano extraído es demasiado grande para cortarlo en pedazos fácilmente, se puede cortar parte del material que pueda representar el órgano. Por ejemplo, del riñón de un perro se puede cortar parte de la corteza, la médula y la pelvis renal.
En segundo lugar, se debe prestar atención a la dirección de corte. Por ejemplo, cuando se toman materiales de órganos tubulares (intestinos, etc.), la sección transversal generalmente se toma como cortes, sin embargo, cuando se observa la pared circular arrugada del intestino delgado, se debe tomar la sección longitudinal.
En tercer lugar, los trozos de tejido deben cortarse pequeños y finos. El bloque de tejido para la preparación de citología no debe exceder los 2 ml. Generalmente, el tamaño del bloque de tejido es de 0,5 × 0,5 × 0,2 cm. El tejido blando es difícil de cortar en trozos pequeños. Se puede tomar un bloque de tejido un poco más grande y fijarlo durante 2. -3 horas. Una vez que el tejido esté un poco duro, córtelo en trozos finos y continúe fijándolo.
2.2 Fijación
Para realizar cortes de cualquier parte de tejido de animales y plantas, primero se deben fijar con reactivos químicos. El objetivo de la fijación es fijarlos en el menor tiempo posible. a través del fijador hace que los protoplastos detengan sus actividades vitales y conserven su estructura celular tan finamente como antes de la vida. Al mismo tiempo, es fácil teñirse en los pasos posteriores. Por lo tanto, un buen fijador debe cumplir las siguientes condiciones: rápidamente. penetrar en el tejido para matar los protoplastos y en poco tiempo, tanto dentro como fuera del tejido, evitar la expansión o contracción del tejido tanto como sea posible, y la suavidad y dureza son adecuadas para seccionar; Índice del contenido de las células para una fácil identificación y aumenta el efecto mordiente y la capacidad de tinción. El fijador es también un fluido antiséptico, evitando que el material se deteriore.
2.3 Deshidratación
La deshidratación consiste en sustituir gradualmente el agua libre de la muestra por un líquido que se pueda mezclar tanto con agua como con líquido transparente. El agente deshidratante utilizado actualmente es generalmente acetona o etanol para la deshidratación en gradiente. El tiempo de deshidratación se puede determinar según el tipo y tamaño del tejido.
El proceso de deshidratación:
Generalmente es 30 etanol → 50 etanol → 70 etanol → 80 → 90 → 100 → 100
La deshidratación debe ser gradual y no debe omitirse si es demasiado grande, provocará una fuerte contracción o deformación del tejido. Al procesarlo con etanol absoluto, se debe garantizar la pureza del reactivo.
2.4 Transparencia
La transparencia consiste en sustituir el alcohol de la muestra por un líquido que se pueda mezclar tanto con alcohol como con medio de inclusión, creando así un entorno favorable para las condiciones de inclusión finales. Los agentes transparentes utilizados actualmente son generalmente xileno, tolueno, cloroformo, etc.
El proceso es: 1/3 xileno 2/3 mezcla de etanol → 1/2 xileno 1/2 mezcla de etanol → 2/3 xileno 1/3 mezcla de etanol → xileno → Xileno
El xileno es el agente transparente más utilizado. Tiene las ventajas de un fuerte poder de penetración, una gran cantidad de parafina disuelta y una fácil volatilización. Su desventaja es que provoca fácilmente la contracción, el endurecimiento y la degeneración del tejido. El tiempo de transparencia debe determinarse según el tamaño y la textura del bloque de tejido.
2.5 Depilación
Sumergir el bloque de tejido que ha completado el paso de limpieza en una mezcla de agente limpiador y parafina, y aumentar continuamente la proporción de parafina hasta que se alcance la transparencia en el bloque de tejido. sustituido completamente por agente de parafina para facilitar el futuro envasado y corte. Hay dos tipos de parafina: líquida y sólida. El encerado debe realizarse en un horno a temperatura constante (60°C) para garantizar que la parafina esté en estado líquido.
2.6 Envoltura
Después de infiltrar el bloque de tejido con parafina, sus espacios internos han sido completamente ocupados por parafina. En este momento, es necesario envolver el bloque de tejido con parafina. la misma dureza en un bloque de cera para facilitar. Se pueden usar los mismos utensilios para cortar y empaquetar en la parte posterior, o se puede doblar una caja de papel kraft.
Vierta lentamente la parafina líquida en la caja, luego use unas pinzas para sujetar suavemente el bloque de tejido empapado en cera en la caja y entiérrelo superficialmente en la parafina. Cuando la parafina se enfríe hasta alcanzar un estado sólido, el. se completa la incrustación.
En este punto, un trozo de tejido ha completado el proceso de preprocesamiento y se puede cortar. Los pasos anteriores muestran que no parece haber una teoría profunda ni una tecnología complicada. Todo parece simple, pero no se logra. hacerlo provocará que toda la producción se desperdicie.
2.7 Seccionamiento
Recorte: Antes de cortar, es necesario recortar el bloque de cera, es decir, un bloque de cera grande incrustado se corta en pedazos de modo que cada trozo pequeño contenga un trozo de tejido, y se corta la parafina alrededor del tejido, el tejido se recorta en un pequeño trozo de cera y se pega a un bloque de madera dura de tamaño adecuado para facilitar la fijación en el microtomo.
Parche: sostenga el cepillo en una mano, gire el microtomo con la otra mano y conecte las rodajas de cera cortadas en una cinta de cera larga
Coloque la cinta de cera cortada un papel negro limpio y córtelo en varias secciones según sea necesario con un cuchillo y péguelas en portaobjetos de vidrio limpios. Aplanar y secar sobre una mesa de exhibición de películas a temperatura constante.
2.8 Tinción
Se pueden utilizar diferentes métodos para secar las secciones y luego teñirlas. Debido a que cada portaobjetos se pega con una cinta de cera, primero debe quitar la parafina con xileno y luego usar alcohol para quitar el xileno y luego ingresar al agua antes de teñir. Existen muchos métodos de tinción y deben seleccionarse según el propósito. de mostrar cada muestra El tinte más comúnmente utilizado es la tinción con hematoxilina con hematoxilina que hace que el núcleo de la célula sea de color púrpura oscuro y la eosina hace que el citoplasma parezca rosado, lo que muestra claramente la morfología celular y el tamaño y la posición del núcleo. El principio básico de la producción de películas es deshidratar el portaobjetos que contiene agua → paso transparente y finalmente sellar el portaobjetos con goma.
Los pasos básicos son los siguientes: xileno × 2 (desparafinado) → alcohol xileno (1 :1 ) → 100 alcohol × 2 → 90 alcohol → 80 → 70 → 50 → 30 → agua → tinción con hematoxilina (examen microscópico) → agua → 50 → 70 → 90 → 0,5 eosina (preparada con alcohol 95) → 95 → 100 × 2→Xileno: Alcohol (1:1)→Xileno × 2→Sellado de encías
Método fácil:
Primero corte varios materiales en rodajas use unas pinzas para sujetarlos firmemente y colóquelos. Coloque una gota de agua en el portaobjetos y coloque la rodaja. Si el color es muy claro, agregue yodo para teñirlo, cúbralo con un cubreobjetos y use una toalla de papel para absorber el agua.