Intercambio de literatura Los imitadores efectores bacterianos actúan como proteínas cliente de HSP90 para subvertir la inmunidad

Lo que comparto esta vez es un artículo "Un efector bacteriano imita a un cliente host HSP 90 para inmunidad encubierta" publicado en Cell en 2020. La primera unidad es el Southwestern Medical Center en Texas, EE.UU. Describe principalmente el efector bacteriano tipo 3 HopBF1, que tiene actividad quinasa y puede fosforilar HSP90 (proteína chaperona molecular, promueve el plegamiento de proteínas, incluidos los receptores inmunes y las quinasas inmunes; ayuda en la activación de NLR; y está ampliamente presente en una variedad de especies. ), inactivarlo y, en última instancia, prevenir la activación de los receptores inmunes, promoviendo así la infección.

Primero, se identificó un efector T3SS en bacterias mediante bioinformática (juzgándolo como una quinasa basada en la estructura de la proteína y la actividad catalítica, en lugar de juzgarlo como una quinasa basada en la secuencia primaria) e inyección artificial: HopF1. HopF1 está presente en muchas bacterias Gram-negativas, incluidas algunas bacterias o bacterias patógenas de animales y plantas.

Al comparar los 161 homólogos de HopBF1, se descubrió que tiene residuos de proteína quinasa conservados, incluido el residuo Gly altamente conservado que se une al ATP y el sitio activo Asp (F1A) de la quinasa clásica PkA. El RMSD (parámetro de similitud estructural) de HopBF1 y PKA aviar (patógeno humano) es 3,2 Angstroms (F1CD). Al comparar y decodificar las estructuras de cada parte, se descubrió que HopBF1 tiene el dominio de quinasa atípico más pequeño.

Debido a que la mayoría de los homólogos de HopBF1 se encuentran en Pseudomonas syringae, Pseudomonas syringae se utiliza principalmente para estudiar su función. HopBF1 y sus formas mutantes activas (D154A, D169A) expresadas en tabaco mostraron una intensa necrosis de la lesión en WT pero no en el mutante (F2AB). Para saber si HopBF1 puede causar necrosis tisular durante el proceso de infección (esta parte del artículo se expresa como muerte celular, personalmente creo que es inapropiado, porque la muerte celular en las plantas generalmente está relacionada con la HR, y obviamente está relacionada con el tamaño de las manchas de droga, posiblemente relacionado con la práctica médica primaria del autor), el mismo fenómeno de necrosis de la lesión (F2CD) también se encontró cuando estas tres formas se expresaron en Pseudomonas syringae efector nulo y luego infectaron Arabidopsis y tabaco. Los experimentos in vivo e in vitro mostraron que la actividad quinasa de HopBF1 juega un papel importante en su patogenicidad en Arabidopsis y tabaco.

Los efectores bacterianos previamente informados a menudo se dirigen a componentes de señalización conservados de eucariotas, y Saccharomyces cerevisiae se utiliza a menudo como sustrato objetivo para la identificación de efectores. HopBF1 y sus formas mutantes se transformaron en Saccharomyces cerevisiae y se descubrió que la forma normal provocaba defectos de crecimiento (F3A). Para identificar sustratos potenciales de HopBF1, HopBF1 y sus formas mutantes se incubaron con extracto de levadura. Los experimentos de rastreo de isótopos muestran que el paradigma de HopBF1 tiene una banda obvia (F3B) cercana a los 80 kDa. Flag-HopBF1 se transfirió a la levadura y la banda cercana a 80 kDa se identificó como HSP82/HSC82 (F3C) mediante IP-MS, que es el homólogo de la HSP90 humana en la levadura. Co-IP verifica que puede interactuar (F3D).

Las pruebas de fosforilación in vitro muestran que HopBF1 puede fosforilar HSP82 (F3E), y HopBF1 de varias bacterias también puede fosforilar HSP82 (por supuesto, algunas no). De manera similar, HopBF1 de Pseudomonas syringae puede fosforilar la HSP90 de trigo y la HSP90β humana, pero no puede fosforilar E. coli y Pseudomonas syringae. La actividad quinasa de HopBF1 parece ser específica, ya que es incapaz de fosforilar los sustratos de fosforilación universales myBP y caseína (F3H). Por lo tanto, HopBF1 parece ser una quinasa que se dirige a la HSP90 eucariota.

La espectrometría de masas identificó los sitios de fosforilación de HSP90 como Ser99 y THR 101 (F4a). La fosforilación no se ve afectada después de la mutación Thr101 (F4B). Ser99 se conserva en la familia HSP90 y controla la unión de HSP90 y ATP (F4 CD). HSP90(S99E) reduce la función ATPasa de la chaperona molecular después de la incubación de HopBF1 con HSP90*** o en una forma constitutivamente activada, lo que es consistente con la función del inhibidor de HSP90 geldanamicina (F4E).

A continuación, los autores querían ver si la función de la chaperona HSP90 se veía afectada por la fosforilación. En células de mamíferos, se transfieren HopBF1 y dos clientes de HSP90, v-src (tirosina quinasa tumoral). Se encontró que el receptor inmune endógeno NLRP3), el nivel de fosforilación de tirosina y el nivel de proteína de v-src y el nivel de proteína de NLRP3 estaban disminuidos (F4FG). Esto también muestra que HopBF1 fosforila HSP90, y la HSP90 fosforilada pierde sus funciones ATPasa y chaperona molecular.

Para explorar la función catalítica de HopBF1, los autores crearon múltiples mutantes en los que el efecto de crecimiento deficiente de HopBF1 en levadura se debilitó después de la mutación iónica del residuo E74A (F4I). La sobreexpresión de HSP90 en levadura transformada con HopBF1 no logró restaurar su defecto de crecimiento, probablemente porque HopBF1 desempeña un papel catalítico (F4H). Estos resultados indican que el defecto de crecimiento causado por HopBF1 en la levadura es el resultado de la fosforilación e inactivación de HSP90.

Las hojas de tabaco que expresan HSP90 fueron infectadas por Pseudomonas syringae que expresa HopBF1 y su forma mutante activa. Los resultados mostraron que las lesiones aparecieron en las hojas al 3er día y se expandieron al 6to día (F5A). Sin embargo, la expresión de HSP90 S100F (mutación del sitio de fosforilación) o YFP por la infección por P. syringae redujo significativamente las lesiones (F5A). La sobreexpresión de HSP90, pero no de S100F, aceleró la formación de lesiones, lo que sugiere que los niveles elevados de Ser100 de HSP90 pueden ser tóxicos para la planta. En conjunto, esto indica que HopBF1 fosforila HSP90Ser100 durante la infección.

En las plantas, la activación de NLR, como RPM1, requiere HSP90. Por tanto, los autores concluyeron que HopBF1 inactiva HSP y evita que RPM1 se active. La expresión instantánea de RPM1 D505V (forma autoactivante) desencadena HR (F5B), * * *La expresión de RPM1 D505V y HopBF1 reduce la HR. Esto indica que HopBF1 interfiere con la activación de RPM1 D505V al fosforilar HSP90, previniendo así la HR

Debido a que HopBF1 interactúa con HSP90, queríamos ver si HopBF1 podría servir como una "proteína cliente" para HSP90.

HopBF1 D170A (forma inactivada) se expresó en 293 células y se trató con inhibidores de HSP90. Se descubrió que los niveles de proteína de HopBF1 D170A y v-src se redujeron después de que se inhibiera HSP90 en la línea celular 293 (F4A).

En eucariotas, HSP90, una chaperona general CDC91, desempeña un papel en la promoción de la maduración de la quinasa cliente. Co-IP descubrió que HSP90 y CDC37 interactuaban con v-src, pero no se detectó CDC37(F6B) en el producto IP de HopBF1. El silenciamiento de CDC37 afecta la interacción entre HSP90 y v-src, pero no la interacción entre HopBF1 y HSP90 (F6C). Esto sugiere que CDC37 no es necesario cuando HopBF1 interactúa con HSP90.

El bucle αC-β4 de la proteína quinasa cliente juega un papel importante en el reconocimiento de HSP90. La mutación de esta región (V89D) reveló que HopBF1 redujo en gran medida el fenotipo del defecto de crecimiento de la levadura. HopBF1 V89D se expresa en bacterias y la proteína puede detectarse. Sin embargo, cuando HopBF1 V89D se expresó en células de mamíferos, no se detectó WB porque la HSP90 dirigida incorrectamente será degradada por la vía del proteasoma (F6E). La proteína se puede detectar después de aplicar MG132, lo que indica que HopBF1 V89D de hecho se degrada por la vía del proteasoma. .

Para aclarar la función de HopBF1 V89D en plantas, las formas normal y mutante de HopBF1 se transformaron en Pseudomonas syringae y luego se infectó tabaco. Se descubrió que HopBF1 expresado normalmente causaba una necrosis tisular significativa, mientras que el mutante de interacción HSP90 HopBF1 V88D o el mutante activo D169A no causaban necrosis tisular. En general,

PD

1. Para el descubrimiento de HopF1, las herramientas bioinformáticas utilizadas son bastante interesantes. Puedes intentar reproducirlos más tarde si tienes tiempo.

3. La levadura es un buen hermano y puede usarse como aperitivo conservado para eucariotas; también puede usarse para detectar proteínas conservadas que interactúan.