Aplicaciones de la microscopía de fuerza atómica

Con el desarrollo de la ciencia y la tecnología, las ciencias de la vida han comenzado a desarrollarse en la dirección de la ciencia cuantitativa. El foco de la mayoría de los experimentos se ha convertido en la relación entre la estructura y las funciones relacionadas de las macromoléculas biológicas, especialmente los ácidos nucleicos y las proteínas. Debido a que AFM tiene un amplio rango de trabajo, puede obtener imágenes directas de muestras biomédicas en su estado natural (aire o líquido) con alta resolución. Por tanto, AFM se ha convertido en una de las herramientas importantes para el estudio de muestras biomédicas y macromoléculas biológicas. Las aplicaciones de AFM incluyen principalmente tres aspectos: observación de la morfología de la superficie de células biológicas; observación e investigación de la estructura y otras propiedades de macromoléculas biológicas; observación de curvas del espectro de fuerza entre moléculas biológicas;

AFM se puede utilizar para observar la morfología de la superficie de células biológicas.

AFM se puede utilizar para observar la morfología de las células y realizar análisis de imágenes. Al observar la morfología de la superficie celular y la estructura tridimensional, se pueden obtener parámetros cuantitativos como el área de la superficie celular, el grosor, el ancho y el volumen. Por ejemplo, AFM se puede utilizar para detectar cambios en la morfología de la superficie celular después de la infección con virus, cambios en la morfología celular y la elasticidad celular de los osteoblastos después de agregar sustratos (cromo cobalto, titanio, titanio vanadio, etc.) y efectos del GTP en la superficie celular. altura de la vesícula de las células exocrinas pancreáticas estudiar el impacto. AFM también se puede utilizar para estudiar la estructura fina de la superficie de las membranas de los glóbulos rojos dañadas por los radicales libres y observar directamente el impacto del daño de los radicales libres en la morfología molecular de las membranas de los glóbulos rojos después de agregar el efecto protector de Ligustrum lucidum.

Observación e investigación sobre la estructura y otras propiedades de macromoléculas biológicas

2.1 Proteínas

En el caso de las proteínas, la aparición de AFM ha impulsado en gran medida el progreso de la investigación. AFM puede observar el comportamiento de adsorción de algunas proteínas comunes, como la albúmina, la hemoglobina, la insulina, los motores moleculares y las opsoninas de fagos en la interfaz sólida, lo que es útil para comprender la biocompatibilidad, el crecimiento celular in vitro, la purificación de proteínas y el envenenamiento de membranas. mucho. Por ejemplo, Dufrene et al. utilizaron AFM para examinar el comportamiento de ensamblaje del colágeno adsorbido en la superficie de materiales de soporte poliméricos. Combinando espectroscopía de fotoelectrones de rayos X y tecnología de etiquetado de radiación, propusieron un modelo geométrico que explica cualitativamente su estructura en capas. Los experimentos de AFM confirmaron la naturaleza a veces continua y a veces discontinua del ensamblaje del colágeno y también proporcionaron características estructurales fibrilares del colágeno a través de la topografía. Quist et al. utilizaron AFM para estudiar el comportamiento de adsorción de albúmina e insulina porcina en sustratos de mica. Basándose en las sustancias similares a montículos de diferentes tamaños en la imagen de AFM, especularon que las proteínas a veces se agregaban y otras se dispersaban. Epand et al. utilizaron la tecnología AFM para estudiar la hemaglutinina de un tipo de virus del resfriado y demostraron por primera vez el proceso en tiempo real de autoensamblaje de una proteína lisógena de membrana para formar el extradominio de la molécula de proteína plegable viral.

En el estudio de la observación AFM de la proteína opsonina del fago (BR) envuelta con una membrana púrpura, se han reflejado concentradamente la mejora del instrumento AFM, la tecnología de detección y la tecnología de preparación de muestras. En las células, los motores moleculares pueden convertir la energía química en movimiento mecánico para evitar errores en las actividades direccionales en las células causados ​​por el movimiento browniano. Estas actividades incluyen: mioplasmina, proteína motora, dineína, helicasa, ADN. La característica única de las proteínas motoras moleculares como la polimerasa y. La ARN polimerasa es que realizan algunas funciones estrechamente relacionadas con las actividades de la vida a lo largo de una trayectoria lineal, como la contracción muscular, el aislamiento de cromosomas durante la diferenciación celular y el reemplazo de orgánulos entre diferentes células y la decodificación y copia de información genética, etc. Debido a la miniaturización de los propios motores moleculares, son susceptibles a una mayor energía térmica y grandes fluctuaciones, lo que hace que comprender cómo funcionan las moléculas del motor de manera adecuada y ordenada se convierta en una tarea desafiante. Gracias al AFM, la gente ya conoce la información estructural de las proteínas de unión a actina y la función reguladora del esqueleto de actina durante el movimiento celular.

2.2 ADN Examinar el comportamiento de una sola molécula del ADN. Las moléculas de ADN no están estrechamente unidas al sustrato en soluciones tampón o soluciones acuosas, lo cual es una de las principales dificultades que enfrenta el AFM en fase líquida. Los reactivos de silanización, como el 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) y el sustrato de mica modificado con bicapa de fosfolípido catiónico para inmovilizar moléculas de ADN y luego utilizar imágenes de AFM en tampón, pueden resolver este problema.

La participación de cationes en la deposición de ADN en condiciones de fase gaseosa ha sido bien desarrollada y es adecuada para la observación AFM. En condiciones de fase líquida, los sustratos de mica modificados con APTES se utilizan más comúnmente. En la actualidad, muchas conformaciones del ADN, como curvaturas, superenrollamientos, estructuras de anillos pequeños, estructuras de hélice de triple cadena, conformaciones de unión de tres vías del ADN, conformaciones intermedias de replicación y recombinación del ADN, estructuras de interruptor molecular y las interacciones de moléculas de fármacos insertadas en el ADN. AFM inspecciona exhaustivamente todas las cadenas de ADN y obtuvo muchos conocimientos nuevos.

2.3 Ácido ribonucleico (ARN)

AFM no ha investigado mucho sobre el ARN. Se han obtenido imágenes AFM de ARN de transferencia cristalizado y ARN viral monocatenario, así como moléculas de ARN monocatenario oligo-Poli(A). Debido a que los cambios estructurales del ARN monocatenario son muy complejos en diferentes condiciones de tampón, no es fácil recopilar imágenes de moléculas de ARN monocatenario. (El uso de AFM para obtener imágenes de moléculas de ARN requiere un procesamiento especial y complejo de la muestra. Bayburt et al. utilizaron el método de ADN fijado con Ni2 + para obtener imágenes AFM de moléculas de ARN Pre-m monocatenario en condiciones de tampón. Su enfoque es el siguiente : (1) Trate el sustrato de mica modificada con Ni2+ con ácido para aumentar la fuerza de unión (2) recoja las moléculas de ARN a 70 °C, enfríelas lentamente a temperatura ambiente y luego colóquelas sobre el sustrato de mica Ni2+ tratado con ácido; utilizando AFM Utilizando tecnología de espectroscopía de fuerza de una sola molécula, en presencia de Mg2+, Liphardt et al. estudiaron el proceso de despliegue mecánico de moléculas de ARN con morfologías variables y descubrieron la transición de la estructura terciaria de estas moléculas de ARN de estructuras en horquilla a triples. estado de conectores de hélice. Luego utilizaron moléculas de ARN para confirmar la equivalencia termodinámica entre la función de trabajo reversible en no equilibrio y la energía libre en equilibrio reversible)

2.4 Complejo de ácidos nucleicos y proteínas (Nucleácidos-Proteínas).

Las interacciones específicas entre el ADN y las moléculas de proteínas juegan un papel clave en la biología molecular. El mapeo preciso de los sitios de unión proteína-ADN y la determinación de los sitios de unión en diferentes estados celulares son fundamentales para comprender las funciones y mecanismos de sistemas celulares complejos, especialmente el control de la expresión génica. AFM, como tecnología de análisis de superficies con una resolución de altura de 0,1 nm y una resolución de ancho de aproximadamente 2 nm, se ha utilizado ampliamente para caracterizar varios tipos de complejos de ADN-proteína. En condiciones atmosféricas de baja humedad, Rees et al utilizaron AFM en modo de contacto para examinar el efecto del promotor λ2PL sobre el grado de flexión de la cadena de ADN durante el inicio y el final de la transcripción. Además, el grupo también estudió el efecto de la proteína Cro, otro factor de transcripción λ2, sobre la flexión del ADN. Para estudiar si la unión de la proteína Jun provocará la curvatura de la cadena de ADN, Becker et al utilizaron AFM para estudiar el complejo de ADN plasmídico linealizado que contiene un sitio de unión AP21 con la proteína Jun. El grupo de Aizawa estudió la correlación entre el subdominio Ku de la proteína quinasa del ADN y las roturas del ADN de doble cadena. Kasas et al. estudiaron la actividad enzimática dinámica de la ARN polimerasa (RNAP) de Escherichia coli durante la transcripción. Su método es que, en presencia de Zn2+, RNAP puede unirse de manera flexible o estrecha a la plantilla de ADN y comprender su proceso dinámico a través de imágenes AFM.

2.5 Celda (Célula)

El AFM no solo puede proporcionar imágenes ultraópticas de la estructura celular límite, sino que también puede detectar las propiedades micromecánicas de las células. Utilizando la tecnología de curva de fuerza AFM, puede. Incluso detecta la estructura celular en tiempo real. Detecta la dinámica celular y los procesos de movimiento celular. El estudio de células con AFM requiere poco tratamiento previo de la muestra, especialmente para poder estudiarlas en condiciones casi fisiológicas.

Utilizando el método de imagen directa AFM, se pueden estudiar en profundidad células vivas fijas y estructuras subcelulares. Estos estudios arrojaron información más detallada sobre la estructura de los orgánulos, las membranas celulares y el citoesqueleto. Al fijar las células en un sustrato y realizar la observación AFM, se pueden obtener características como arrugas en la estructura de la membrana celular, grasa laminar, microtelofilamentos y microvellosidades. Dado que la membrana citoplasmática enmascara el esqueleto interno de la célula, se ha desarrollado un método para despegar cuidadosamente esta membrana, y se utilizó AFM para estudiar la estructura después de despegar la membrana celular.

Uno de los usos más importantes del AFM en la investigación celular es realizar imágenes en tiempo real de los procesos dinámicos de las células vivas, las interacciones entre células y las respuestas de las células a factores de interferencia internos y externos. AFM ya puede obtener imágenes externas de células infectadas por virus en tiempo real. AFM también puede estudiar los cambios en la forma de las plaquetas en estado activo y la respuesta de las células pancreáticas cultivadas a las enzimas que digieren el almidón.

2.6 Virus

En sus inicios, la aplicación del AFM en biología se centraba principalmente en la investigación de virus. Kolbe et al. estudiaron por primera vez el fago T4 con diferentes estructuras de cabeza y cola. Imai y sus colaboradores observaron el virus del mosaico del tabaco y varios tipos de bacteriófagos. El virus del mosaico del tabaco (TMV) o virus del mosaico del tabaco en forma de estrella (STMV) es el tipo de virus más estudiado hasta la fecha. En soluciones coloidales, el TMV se comporta de manera muy parecida a las proteínas conocidas y puede estudiarse de la misma manera que las proteínas. Utilizando AFM, se puede estudiar el proceso bidimensional de nucleación y crecimiento de TMV en condiciones altamente sobresaturadas y ligeramente sobresaturadas. Los estudios de AFM han demostrado que cuando TYMV se expone a una solución en condiciones de equilibrio, la superficie (101) del cristal de TYMV crece hacia arriba capa por capa, y los defectos estructurales de la red cristalina, como vacantes, partículas individuales, dislocaciones y agregaciones, pueden desaparecer. distinguirse en el diagrama AFM. Muy claro. Turner et al. utilizaron la transcriptasa inversa extraída del virus del SIDA para modificar el haz de AFM, convirtiéndolo en un método que puede detectar la actividad de enzimas inhibidoras y detectar fármacos que inactivan el virus del SIDA. La unión de membranas de fosfolípidos autosoportadas a virus del resfriado y la detección de efectos de monocapa de fosfolípidos expuestos al sustrato y fosfolípidos de bicapa hidratados en estructuras de sitios defectuosos se desarrollaron en un nuevo biosensor capaz de identificar macromoléculas de otras macromoléculas virales específicas. Estos resultados fueron confirmados por imágenes AFM.

Observación de curvas del espectro de fuerzas entre biomoléculas

Medir diversas fuerzas de interacción en la superficie de biomoléculas es una función muy importante del AFM. Esto es muy significativo para comprender la estructura y las propiedades físicas de las biomoléculas. Porque esta fuerza determina la atracción o repulsión mutua de dos moléculas, el acercamiento o la salida, la formación o ruptura de enlaces químicos, el mantenimiento o cambio de la conformación tridimensional de biomoléculas, etc. Bajo el control de fuerzas intermoleculares, también controla diversos fenómenos fisiológicos, fenómenos bioquímicos, fenómenos farmacológicos en los organismos, así como la apertura o cierre de canales iónicos, la unión o desasociación de receptores y ligandos y la función de activación de enzimas. o inhibición, etc. Por tanto, el estudio de las fuerzas entre biomoléculas es, en cierto sentido, el estudio de los principios más fundamentales en las actividades funcionales de los organismos vivos. Esto también proporciona un nuevo método de investigación y una herramienta para que las personas comprendan los principios de la vida.

Fija las dos moléculas en la base y la punta de la sonda del AFM respectivamente. Luego, la punta de la sonda que transporta una molécula se mueve verticalmente hacia y alejándose de otra molécula en el sustrato. En este momento, la fuerza de interacción entre las dos moléculas es función de la distancia relativa entre ellas. Esta curva de relación funcional entre fuerza y ​​distancia se llama curva de espectro de fuerza.

Aplicación de las curvas del espectro de fuerzas obtenidas por AFM en biomedicina: Tras detectar una célula, AFM asignará un valor que indica la suavidad de la célula en función de la resistencia encontrada. Los investigadores descubrieron que, si bien las células normales varían en rigidez, las células cancerosas son mucho más blandas que las normales. Esto fue cierto para las células del páncreas, los pulmones y la mama estudiadas. Las células de algunos tumores pueden ser más resistentes que otras, lo que significa que es menos probable que estos tumores hagan metástasis y representen una amenaza menor para los pacientes. El AFM también se puede utilizar para estudiar los efectos de diferentes fármacos sobre las células cancerosas. Después de atacar las células con medicamentos, AFM puede observar los cambios en las células bajo la acción de los medicamentos. Esto podría conducir al desarrollo de medicamentos que sean menos tóxicos que los utilizados actualmente, pero que también puedan evitar que las células normales se vuelvan cancerosas, lo que puede conducir a una propagación del cáncer potencialmente mortal.