¿Las muestras congeladas tienen un gran impacto en la secuenciación unicelular?
El 31 de diciembre de 2019 (¡realmente cogiendo la cola del 2019!), un equipo de investigación del Instituto Wellcome Sanger en el Reino Unido publicó un artículo titulado "Estabilidad de los tejidos humanos de pulmón, bazo y esófago después de la criopreservación". "El artículo "ScRNA-Seq Assessment Research Content" explora el impacto de la criopreservación de muestras y el tiempo de criopreservación en la secuenciación del transcriptoma unicelular de pulmones, bazo y esófago humanos.
Para abordar los rápidos cambios transcripcionales/respuestas de estrés causados por la disociación o preservación del tejido, se han desarrollado una serie de métodos de fijación o congelación de células. Guillaumet-Adkins et al. demostraron que, aunque la viabilidad de las células cultivadas o de las biopsias de ratón trituradas se redujo después de la criopreservación con DMSO, no hubo cambios significativos en el perfil transcripcional. Sin embargo, algunos tipos de células son más susceptibles a la congelación que otros. Por ejemplo, en biopsias de endometrio humano, las células estromales tienen una tasa de supervivencia mayor que las células epiteliales en condiciones de congelación. Además, varios estudios han evaluado la capacidad de los fijadores de reticulación tradicionales, los agentes de reticulación reversibles, las alternativas sin reticulación (p. ej., metanol) y otros estabilizadores novedosos para fijar las células. Aunque la fijación suele producir un sesgo 3', puede evitar cambios en la transcripción y garantizar que los tipos de células no cambien. Hasta la fecha, estos reactivos sólo se han probado en células disociadas o, como máximo, en tejido triturado, y no en muestras de tejido intactas. Desafortunadamente, a menudo no es práctico aislar muestras clínicas humanas antes del transporte y, a menudo, es difícil separar bloques de tejido fijados mediante métodos mecánicos o enzimáticos tradicionales.
En este estudio, los autores pretendieron identificar un método de conservación de tejido que garantice que el estado transcripcional de muestras de tejido intactas para scRNA-seq permanezca estable con una manipulación clínica mínima y un tiempo de envío determinado. Para contribuir a un proyecto de mapeo de células humanas, los autores probaron el método en tres tejidos primarios humanos con diferentes sensibilidades a la isquemia: el bazo (el más estable), la mucosa esofágica y el pulmón (el menos inestable). Estos tejidos contienen muchos tipos de células diferentes, desde células inmunitarias hasta queratinocitos. Se recolectan muestras de donantes de órganos fallecidos y se perfunden con una solución fría de conservación de órganos rápidamente después de la muerte del donante.
El conjunto de 240.000 datos unicelulares generados por este estudio incluye el conjunto de datos unicelulares más grande sobre esófago y bazo humanos publicado hasta la fecha. Los datos se pueden ver y analizar en www.tissuestabilitycelllas.org. Se encontró que los bloques de tejido intactos de estos tres órganos se almacenaron en criosol FRS a 4°C durante 24 horas o 72 horas (la mayoría de las muestras se almacenaron durante 72 horas), y luego se secuenciaron los transcriptomas de células individuales normales y enriquecidas con 10x 3'. El impacto no es grande. Los resultados de diversidad de poblaciones obtenidos por scRNA-seq no cambiaron al aumentar el tiempo de congelación. Muchas instituciones clínicas deberían adoptar fácilmente este protocolo y permitir al menos un período de 24 horas para el envío de muestras a los colaboradores, aumentando así las posibilidades de obtener tejido humano fresco para la investigación.
Los autores obtuvieron muestras de pulmón, esófago y bazo de 12 donantes de órganos y las evaluaron mediante secuenciación del genoma completo y diapositivas de patología. Todas las muestras eran muestras sanas para evitar que ciertas glándulas o inflamación en las muestras afectaran la evaluación de los resultados de scRNA-seq. Las muestras frescas se disociaron inmediatamente (T0) o se volvieron a disociar después de 12 h, 24 h y 72 h de isquemia fría a 4 ° C, y luego se sometieron a secuenciación unicelular utilizando 10X 3'v2 scRNA-seq. Como se muestra en la figura siguiente, después de comparar y normalizar los datos de scRNA-seq, se evaluaron los indicadores de control de calidad de todas las muestras. Para los pulmones y el esófago, los indicadores de calidad como el número de lecturas por muestra, el número de células por muestra y el número medio de genes detectados por célula no cambiaron significativamente con el tiempo, pero la tasa comparativa de lecturas de muestras para los órganos del bazo almacenados durante 72 horas disminuyó significativamente.
Conclusión: El autor no detectó cambios en los indicadores de control de calidad relacionados con la duración del tiempo de isquemia fría dentro de las 24 horas posteriores al tiempo de isquemia fría. (Tiempo de isquemia fría: el tiempo desde la perfusión fría (conservación en frío) hasta el suministro de sangre después del trasplante).
Figura 1
Un análisis más detallado muestra que el porcentaje de lecturas de exones solo es significativamente disminuido en el bazo (Fig. 2a, B).
Además, solo el porcentaje de lecturas de intrones aumentó con el tiempo de almacenamiento en muestras de bazo (Fig. 2c, D). Los cambios en la proporción de lecturas de alta calidad en el bazo a las 72 h (Fig. 2b, c) pueden conducir a diferencias específicas del tipo de célula, que se analizarán con más detalle en los resultados a continuación. La proporción de lecturas de intrón a exón cambia de manera más significativa entre el 25% superior de lecturas de exón de alta calidad y el 75% superior de lecturas de intrón de alta calidad, lo que sugiere que las lecturas no empalmadas son más estables a la degradación (esta conclusión es un poco extraño, pídale orientación a un amigo conocido). Finalmente, los investigadores también encontraron que el porcentaje de expresión de genes mitocondriales en el bazo aumentó significativamente solo con el tiempo (Fig. 2e, f, g).
Figura 2 (diagrama de caja de aprendizaje del lenguaje R (diagrama de violín, diagrama de fluctuación, diagrama de dispersión de área))
Primero, la fracción doble de gotas en los tres tejidos no cambia con tiempo .
A continuación, los autores evaluaron los cambios en las gotitas acelulares. Todas las reacciones de secuenciación basadas en gotitas producen muchas gotitas que no contienen células pero que capturan ARNm en el medio ambiente, a menudo llamado ARN ambiental o sopa. Se establecieron umbrales relativamente arbitrarios para el número de UMI normalizados por gota, que se definieron como 0-0,25 para el ARN ambiental, 0,25-5 para fragmentos y UMI normalizado> 5 para cada gota, para reflejar la distribución de lecturas (Fig. 3a). . El tiempo de refrigeración de las muestras de bazo, pulmón o esófago no tuvo un efecto significativo sobre la proporción de gotitas que contienen UMI. El UMI normalizado promedio de gotitas de tipo fragmento en el bazo aumentó a las 72 h, mientras que el de gotitas celulares disminuyó (Fig. 3b, c). Este fenómeno no se observó en muestras de pulmón o esófago. Sin embargo, el IUM normalizado promedio de gotas de desechos y material celular varió mucho entre los tres órganos.
Figura 3
En los pulmones, 57.020 células pasaron el control de calidad y fueron etiquetadas para 25 tipos de células. En los vasos sanguíneos y linfáticos se detectaron cilios, células alveolares 1 y 2, fibroblastos, células musculares y endoteliales. Los tipos de células identificadas en el compartimento inmunológico incluyeron células NK, T y B, dos tipos de macrófagos, monocitos y células dendríticas (DC). Se detectaron varias subpoblaciones de células DC, como cDC1, DC plasmocitoide (pcDC) y DC activadas, que representan el 0,3% (163 células), el 0,08% (46 células) y el 0,2% (122 células) de todas las células, respectivamente. Se detectaron genes marcadores de células del club alveolar en algunas células, pero el algoritmo de agrupamiento no agrupó estas células individualmente (la resolución de esta clasificación también fue alta, con las 46 poblaciones de células separadas, ya sea debido a la resolución inicial La tasa es alta, quizás debido a la subdivisión de grupos celulares. Aunque la agrupación es intuitiva, requiere intentos repetidos de dividir tantos grupos significativos como sea posible para mantener la estabilidad de los resultados de la agrupación.
Después del control de calidad, quedaron 87.947 células en la muestra esofágica, más del 90% de las cuales pertenecían a los cuatro tipos principales de células epiteliales: suprabasal, graduada, suprabasal y suprabasal de células en división. Otras células de la capa basal del epitelio están más apretadas en conductos glandulares y células secretoras de moco. Las células inmunes en el esófago incluyen células T, células B, monocitos, macrófagos, CD y mastocitos. Curiosamente, casi el 80% de los mastocitos (87 células) procedían de un único donante. La proporción de otras células inmunes (células B, CD, monocitos/macrófagos) aumentó en este donante. A este donante se le diagnosticó neumonía asociada a la ventilación mecánica y se le excluyó de comparaciones posteriores.
Las 94.257 células del bazo fueron etiquetadas como células inmunes. Las células B foliculares y B del manto se consideran las poblaciones de células más grandes, representando el 17% (:16.000 células) y el 20% (>:18.000 células), respectivamente. Se detectaron más de 6.000 células plasmáticas, marcadas como plasmocitoblastos, y las células plasmáticas expresaron IgG o IgM. Más de 28.000 células T marcadas como células clásicas CD4+, células activadas CD8+, células CD4+ vírgenes, células auxiliares foliculares (fh) CD4+, células similares a MAIT CD8+, células gamma-delta CD8+, linfocitos citotóxicos (CTL) CD8+, células reguladoras CD4+ o células T mitóticas. También se identificaron dos subpoblaciones de células asesinas naturales (NK), la subpoblación NK mitótica, monocitos, macrófagos y CD.
La proporción de poblaciones multicelulares es muy baja, como las subpoblaciones de DC, incluidas las DC activadas (0,04%), las DC 1 convencionales (0,3%) y las PCDC-S (0,3%), así como los linfocitos innatos (0,6%), CD34+. células progenitoras (0,2%) y plaquetas (0,08%). Las subpoblaciones celulares que contienen más de 2207 marcadores de células T y células B simultáneamente pueden representar dobletes de células que interactúan, denominados dobletes T_B.
Figura 4
Después de etiquetar los tipos de células, se pueden estudiar los cambios en la proporción de composición del tipo de célula con el tiempo de almacenamiento en frío. La proporción de tipos de células varió ampliamente entre muestras y donantes. Al examinar los cambios en los tipos de células a lo largo del tiempo en los donantes, notamos que la proporción de células B en el bazo (Figura 4f) aumentó con el tiempo de almacenamiento (obsérvese el área de la columna naranja en la figura), mientras que en los pulmones (Figura 4d) y La proporción de células T (observe el área de la columna azul en la figura) en el bazo (Figura 4f) disminuyó al aumentar el tiempo de almacenamiento (Figura 4d-f, d pulmón, e esófago y F bazo) (Nota: d, E , f Las subfiguras de E y F corresponden verticalmente a A, B y C respectivamente, pero agregar un título a cada figura facilita la lectura de la figura).
A continuación, los autores investigaron si el efecto del tiempo de almacenamiento en el transcriptoma era específico del tipo de célula. En particular, los perfiles UMAP calculados a partir de genes altamente variables no cambiaron significativamente con el tiempo (Fig. 4g, h). Se integraron matrices de expresión génica para todos los tejidos y se calculó el porcentaje de variabilidad explicada por diferentes variables. Como se muestra en la Figura 4j, diferentes donantes, tejidos, tipos de células y totales de células UMI explicaron la mayor proporción de fuentes de variación, mientras que el tiempo de almacenamiento tuvo el efecto más pequeño (línea morada). (Si desea realizar este análisis, consulte el artículo "Cómo identificar factores de confusión en transcriptomas unicelulares").
Los autores proponen un método de almacenamiento en frío para muestras de tejido primario humano, además de recolectar muestras en el sitio clínico, no requiere ningún procesamiento y tiene un tiempo mínimo de manipulación de 24 horas para el envío, la disociación de tejidos y la secuenciación de scRNA-seq. Los indicadores de calidad de las muestras de pulmón y esófago se mantuvieron estables dentro de las 72 horas posteriores a la refrigeración. En el bazo, observamos cambios en la proporción de lecturas intrónicas y de exones y un aumento en el porcentaje de lecturas mitocondriales a las 72 h.
Los resultados muestran que colocar muestras de tejido en una solución fría de conservación de tejido inmediatamente después de la recolección garantiza que los diferentes tipos de células se vean mínimamente afectados después de la isquemia. El tiempo de refrigeración no tuvo ningún efecto sobre la diversidad de las poblaciones celulares ni sobre los cambios en la secuencia de ARN general dentro de las 24 horas posteriores a los datos de secuencia de ARNc.
Además, el autor también proporciona recursos de datos para el pulmón, el bazo y el esófago, que abarcan células individuales, transcriptomas comunes, secuenciación del genoma completo y datos clínicos. , para su posterior análisis y uso por parte de científicos en el campo.
Con tanta cantidad de datos, sólo se ha publicado una biología del genoma. ¿Es un poco excesivo? Entonces, ¿se puede explorar más a fondo este recurso de datos?
|Revisión: Colección de Cartas de Vida