¿Cuál es la ecuación de la reacción de biuret?
Método biuret mejorado para una determinación rápida del contenido de proteínas
(1) Principio del método
Las proteínas tienen más de dos enlaces peptídicos, por lo que se produce la reacción de biuret . En solución alcalina, la proteína y el Cu forman un complejo rojo púrpura, cuya intensidad de color es proporcional a la concentración de la proteína y no tiene nada que ver con el peso molecular ni la composición ácida básica de la proteína. La reacción del color se ve muy afectada por la temperatura. Toma 1 hora a temperatura normal (20~25 ℃), 15 minutos a 40 ℃ y 5 minutos a 60 ℃.
(2) Instrumentos y equipos
1. Instrumento colorímetro fotoeléctrico; centrífuga (4000 rpm); balanza analítica (sensible a 0,0001 g o 0,001 g). Agitador o temperatura constante; baño de agua; tubo de centrífuga, pipeta graduada.
2. Reactivo 4 solución de sulfato de cobre (CuSO4 ·5H2 O); 2,5 solución de tartrato de sodio y potasio; preparación del reactivo de biuret: En un matraz aforado de 500 ml, agregar en secuencia 30 ml y 2,5 4CuSO4 ·5H2 O. 100 ml de tartrato de sodio y potasio, luego agregar lentamente 30 ml de KOH 5 mol/L y finalmente diluir hasta la marca con agua destilada. Al usarlo, mezcle la solución anterior con alcohol isopropílico con buena transparencia.
(3) Pasos de determinación
1. Preparación de la curva estándar de caseína: pesar 2 gramos de proteína de caseína doméstica (molida a malla 80) en una solución de KOH de 0,15 mol/l, calentar hasta disolver y ajustar el volumen a 100 ml. Tomar 8 porciones de 0,2 a 0,9 ml de esta solución, agregar 10 ml de reactivo de biuret, agitar en un oscilador de baño de agua a temperatura constante a 60 °C durante 5 minutos para completar el desarrollo del color y luego. separar a 4000 rpm Centrifugar por 10 minutos, tomar el líquido centrifugado y realizar medición colorimétrica con un vaso colorimétrico de 1cm a una longitud de onda de 550nm. El blanco es un reactivo sin caseína. Al mismo tiempo, tome 5 ml de esta solución (muestra doble) para la determinación de nitrógeno Kjeldahl y multiplíquelo por el factor de conversión 6,41 para obtener el contenido de caseína. La regresión se realiza basándose en el valor de densidad óptica medido y el contenido de caseína correspondiente, y se calcula la ecuación de regresión Y=a bX (X es la densidad óptica de caseína, Y es el contenido de caseína correspondiente en gramos).
2. Procesamiento y determinación de la muestra: La muestra se tritura y muele para pasar por un tamiz de malla 40, y se mide el contenido de proteína con muestras de peso secadas al aire o muestras de peso secadas al horno. Pese con precisión 0,1000 gramos de la muestra a analizar en una balanza analítica, colóquelos en un matraz de digestión Kjeldahl seco de 25 ml o en un tubo de ensayo grande, coloque unas cuantas perlas de vidrio en él, agregue 10 ml de reactivo de biuret y agite en una balanza analítica. Baño de agua a temperatura constante a 60°C. Agite el instrumento durante 5 minutos y luego centrifugue a 4000 rpm durante 10 minutos. Tome el líquido centrifugado y realice una medición colorimétrica con una copa colorimétrica de 1 cm a una longitud de onda de 550 nm. solución reactiva sin añadir muestra.
(4) Cálculo de resultados
Sustituya el valor de densidad óptica medido de la muestra en la ecuación de regresión de caseína Y=a bX (donde X representa el valor de densidad óptica de la muestra y Y representa el contenido de proteína del gramo de muestra). Luego, multiplicado por el factor de liberación de 1000, se obtiene el contenido de proteína (gramos) en 100 gramos de muestra.
Notas:
(1) Después de mezclar la solución de muestra con alto contenido de grasa y reactivo de biuret, si hay un precipitado nebuloso, se debe dejar reposar durante más de dos horas. y luego centrifugar y tomar el líquido transparente para comparar el color.
(2) El alcohol isopropílico puede reducir la solubilidad del almidón, lo que resulta beneficioso para la extracción de proteínas y el desarrollo del color.
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