Observación morfológica de la apoptosis
1. Observación con microscopio óptico ordinario
2. Observación con microscopio electrónico de transmisión
3. Observación con microscopio de fluorescencia 1) Tinción con hematoxilina-eosina (HE): el núcleo es picnótico y fragmentado, de color negro azulado y el citoplasma es de color rojo claro (las células apoptóticas los núcleos de las células normales son uniformemente azul claro o azul, y los núcleos de las células necróticas son de un azul muy claro o el azul desaparece). 2) Tinción de Giemsa, tinción de Wright, etc., el color de los núcleos de las células normales es uniforme, las células apoptóticas se tiñen más oscuras y las células necróticas se tiñen ligeramente o no se tiñen 1) El volumen celular se vuelve más pequeño y se contrae en todos los ámbitos;
2) Los cuerpos apoptóticos son varios cuerpos redondos que rodean las células. Las células apoptóticas se vuelven más pequeñas y su citoplasma se concentra.
Los cambios morfológicos en la cromatina nuclear durante la apoptosis se dividen en tres etapas: en la etapa I, el núcleo está corrugado o arrugado, y parte de la cromatina aparece condensada; en la etapa IIa, la cromatina en el núcleo está; en estado condensado. Altamente condensado y marginado; los núcleos celulares en el estadio IIb se rompen en fragmentos y se producen cuerpos apoptóticos. Tintes fluorescentes de uso común: naranja aridina, PI, DAPI, Hoechst33258 y Hoechst33342, EB, etc.
Hoechst 33342, Hoechst 33258, DAPI, los tres tintes no están incrustados en su unión al ADN y se unen principalmente a la región base A-T. Emite una fluorescencia azul brillante cuando se excita con luz ultravioleta.
1) Principio básico del método de doble tinción con PI
Hoechst es un tinte reactivo que se une específicamente al ADN y puede ingresar a las membranas celulares normales sin tener mucho efecto citotóxico en las células. La intensidad de fluorescencia de Hoechst 33342 es mayor en células apoptóticas que en células normales.
DAPI es semipermeable y se utiliza para la tinción rutinaria de células fijadas.
El yoduro de propidio (PI) es un colorante de ácido nucleico que no puede penetrar la membrana celular intacta. Sin embargo, en las células en las etapas media y tardía de la apoptosis y en las células muertas, el PI puede penetrar la membrana celular y teñirla. núcleo rojo. Por lo tanto, al combinar la anexina V con el PI, las células en las etapas temprana y tardía de la apoptosis se pueden distinguir de las células muertas. Principio: El derivado desoxirribonucleótido digoxina [(digoxigenina)-11-dUTP] se puede incorporar en el extremo 3-OH del ADN bicatenario o monocatenario de células apoptóticas bajo la acción de la enzima TdT, y se forma con heteromultímeros dATP y se une. a anticuerpos anti-digoxigenina unidos a una enzima informadora (peroxidasa o fosfatasa alcalina). En presencia de un sustrato adecuado, la peroxidasa puede producir una fuerte reacción de color y localizar de forma específica y precisa células apoptóticas, de modo que pueda observarse con un microscopio óptico común.
La planta dedalera es la única fuente de digoxina. Los ligandos capaces de unirse a la antidigoxigenina son casi inexistentes en todos los tejidos animales, por lo que las respuestas inespecíficas son bajas. La reactividad cruzada de los anticuerpos anti-digoxina específicos con las hormonas esteroides de vertebrados es inferior a 1. Si la parte Fc del anticuerpo se elimina mediante hidrólisis de proteasa, se puede eliminar por completo la adsorción no específica de los receptores Fc celulares.
Este método se puede utilizar para determinar la apoptosis en secciones de tejido fijadas con formalina e incluidas en parafina, secciones congeladas y células cultivadas o aisladas de tejidos. 1. Tampón fosfato PBS (pH 7,4): fosfato sódico 50 mM, NaCl 200 mM.
2. Proteinasa K (200μg/ml, pH 7,4): Proteinasa K 0,02g PBS 100ml.
3. Tampón PBS que contiene 2H2O2 (pH 7,4): H2O2 2,0 ml;
4. Tampón enzimático TdT (recién preparado): 3,63 g de base Trlzma, ajustar el pH a 7,2 con HCl 0,1 N, añadir ddH2O para llevar el volumen a 1000 ml, luego añadir 29,96 g de dimetilarsenato de sodio y Cloro Cobalto 0,238g.
5. Solución de reacción de la enzima TdT: 32 μl de enzima TdT; 76 μl de tampón de enzima TdT, mezclar bien y colocar en hielo para su uso posterior.
6. Tampón de reacción de lavado y terminación: 17,4 g de cloruro de sodio; 8,82 g de citrato de sodio; 1000 ml de ddH2O
7. Solución de diaminobifenilo (DAB): 5 mg de DAB; 7,4, filtrar antes de usar, añadir peróxido de hidrógeno al 0,02.
8. 0,5 verde de metilo (pH 4,0): 0,5 g de verde de metilo; 100 ml de acetato de sodio 0,1 M.
9.100 butanol, 100, 95, 90, 80 y 70 etanol, xileno, solución neutra de formaldehído 10, ácido acético, agua de colofonia, etc.
10. Anticuerpo antidigoxigenina marcado con peroxidasa (ONCOR) 1. Preprocesamiento de la muestra:
⑴ Preprocesamiento de secciones de tejido incluidas en parafina: Coloque las secciones de tejido en una cuba de teñido. , lavar dos veces con xileno durante 5 minutos cada vez. Lavar dos veces con etanol absoluto, 3 minutos cada vez. Lavar una vez con etanol 95 y 75, 3 minutos cada vez. Lavar con PBS durante 5 minutos, agregar solución de proteinasa K (20 ug/ml) e hidrolizar a temperatura ambiente durante 15 minutos para eliminar las proteínas del tejido. Lave con agua destilada 4 veces, 2 minutos cada vez, y luego siga el paso 2 a continuación.
⑵ Pretratamiento de secciones de tejido congelado: Coloque las secciones de tejido congeladas en formaldehído neutro al 10%, fije a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego retire el exceso de líquido. Lavar dos veces con PBS, 5 min cada vez. Colocar en una solución de etanol:ácido acético (2:1), tratar a -20°C durante 5 minutos y eliminar el exceso de líquido. Lave dos veces con PBS, 5 minutos cada vez, y luego siga el paso 2 a continuación.
⑶ Pretratamiento de células cultivadas o aisladas de tejidos: Fijar aproximadamente 5 × 107 células/ml en formaldehído neutro al 4% a temperatura ambiente durante 10 min. Deje caer de 50 a 100 l de suspensión celular en el portaobjetos de vidrio y déjelo secar. Lave dos veces con PBS, 5 minutos cada vez, y luego siga el paso 2 a continuación.
2. Añade PBS que contenga 2 peróxido de hidrógeno al tanque de color y reacciona a temperatura ambiente durante 5 minutos. Lavar dos veces con PBS, 5 min cada vez.
3. Utilice papel de filtro para absorber cuidadosamente el exceso de líquido alrededor del tejido en el portaobjetos, agregue inmediatamente 2 gotas de tampón de enzima TdT a la sección y déjela a temperatura ambiente durante 1 a 5 minutos.
4. Utilice papel de filtro para absorber cuidadosamente el exceso de líquido alrededor de las rodajas, agregue inmediatamente 54 μl de solución de reacción enzimática TdT sobre las rodajas, colóquelo en una caja humidificada y reaccione a 37 °C durante 1 hora (nota). : para control de tinción negativo, agregue solución de reacción enzimática TdT que no contenga solución de reacción enzimática TdT).
5. Coloque las secciones en la tina de tinción, agregue el tampón de reacción de lavado y terminación que ha sido precalentado a 37 °C, incube a 37 °C durante 30 minutos y levante y baje suavemente los portaobjetos cada vez. 10 minutos, haciendo que el líquido se revuelva ligeramente.
6. Lave las secciones de tejido con PBS tres veces durante 5 minutos cada vez. Agregue dos gotas de anticuerpo anti-digoxigenina marcado con peroxidasa directamente sobre las secciones y reaccione en una caja humidificada a temperatura ambiente durante 30 minutos. .
7. Lavar 4 veces con PBS, 5 minutos cada vez.
8. Agregue la solución 0,05 DAB recién preparada directamente sobre las secciones de tejido y desarrolle el color a temperatura ambiente durante 3 a 6 minutos.
9. Lavar con agua destilada 4 veces, las primeras 3 veces durante 1 minuto cada vez y la última vez durante 5 minutos.
10. Contrateñir con verde de metilo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lavar 3 veces con agua destilada, levantar y bajar el portaobjetos 10 veces en las dos primeras veces y dejar reposar durante 30 s en la última vez. Siga el mismo método y lave tres veces con 100 n-butanol.
11. Deshidratar con xileno tres veces durante 2 minutos cada vez. Después de sellar y secar, observar y registrar los resultados experimentales bajo un microscopio óptico. Asegúrese de configurar controles celulares positivos y negativos. Las secciones de control positivo pueden usar muestras parcialmente degradadas por DNasaI. Los controles de células positivas pueden usar timocitos grandes o de ratón o linfocitos de sangre periférica humana tratados con dexametasona (1 μM) durante 3 a 4 horas. Al control negativo no se le añadió enzima TdT y los pasos restantes fueron los mismos que en el grupo experimental.
Las células suelen sufrir una muerte programada, o apoptosis, tras un daño irreparable en el ADN.
Sin embargo, este mecanismo pierde su función en las células tumorales, por lo que pueden proliferar sin sentido y negarse a aceptar la orden de "suicidio". Los científicos alemanes han descubierto una posible razón: las células tumorales degradan una proteína que desencadena la apoptosis. Inhibir la degradación de esta proteína restablece la función de los mecanismos apoptóticos y aumentaría la eficacia de la radioterapia y la quimioterapia. El artículo relevante fue publicado en Nature Cell Biology.
Un tipo de proteína que desencadena la apoptosis después de un daño severo en el ADN es la molécula HIPK2. Thomas Hofmann, del Centro Alemán de Investigación del Cáncer, y sus colegas descubrieron que HIPK2 se produce constantemente en las células sanas, pero una enzima llamada Siah-1 lo marca como "basura", por lo que se degrada inmediatamente.
Las células ligeramente dañadas entrarán en un estado de alerta de bajo nivel, inhibiendo la degradación de HIPK2 durante un corto período de tiempo. Una vez reparado el daño, las células reanudan inmediatamente la degradación de HIPK2. Sólo en células con daños graves (como daños en ambas cadenas de ADN) se inhibe permanentemente la degradación de HIPK2. Como resultado, HIPK2 continúa acumulándose, provocando apoptosis y suicidio celular.
Los investigadores especulan que esta puede ser la razón por la que la radiación y la quimioterapia a veces fallan. Ambos tratamientos dañan gravemente las células tumorales y, en última instancia, provocan su muerte programada. Thomas Hofmann dijo: "Si se produce resistencia, a menudo es porque las células tumorales 'se niegan' a ejecutar la orden de suicidarse".
Los investigadores inhibieron la enzima Siah-1 en el experimento y descubrieron que Incluso en lesiones menores en las células, HIPK2 también puede acumularse y se desencadena la apoptosis. Hofmann especuló: "La medicina contra el cáncer probablemente aprovechará este descubrimiento. Por ejemplo, podemos usar inhibidores de Siah-1 en combinación con radiación o quimioterapia para hacer que las células vuelvan al mecanismo apoptótico".