La historia del desarrollo de los anticuerpos monoclonales
La tecnología monoclonal es una alta tecnología biológica desarrollada en los últimos 20 años. Ya en 1975, estableció la tecnología de hibridoma de linfocitos B y ganó el Premio Nobel de Medicina en 1984. El desarrollo de la tecnología de anticuerpos ha pasado por tres etapas; el establecimiento de la tecnología de hibridoma de linfocitos B en 1975 permitió el desarrollo de anticuerpos de primera generación (anticuerpos policlonales séricos) en anticuerpos de segunda generación (anticuerpos monoclonales).
La aparición de los anticuerpos monoclonales ha jugado un papel sumamente importante en el impulso del desarrollo de la biología y la inmunología. En la era so, la tecnología de ingeniería genética se desarrolló rápidamente y se aplicó en el campo de la tecnología de anticuerpos, especialmente el establecimiento y mejora de la tecnología de bibliotecas de anticuerpos en los primeros años, lo que llevó al desarrollo de la tecnología de anticuerpos en la tercera generación de anticuerpos (genéticamente). anticuerpos diseñados). La tecnología de hibridoma de linfocitos B consiste en fusionar células de mieloma que pueden proliferar in vitro durante mucho tiempo y linfocitos B que pueden producir anticuerpos en el híbrido OInacell, de modo que conserven las características de sus padres, es decir, las características y capacidades de las células de mieloma que pueden proliferar in vitro durante mucho tiempo. Características de los linfocitos B productores de anticuerpos.
Las células del hibridoma pueden seguir secretando una gran cantidad de anticuerpos específicos durante un cultivo in vitro a largo plazo. Dado que las células de mieloma y los linfocitos B se derivan en su mayoría de la misma cepa de ratones BIC, también se denomina tecnología de hibridación de tumores de linfocitos B derivados de ratón.
Existen muchos tipos de reactivos monoclonales que se utilizan actualmente para la detección inmunológica, incluidos casi 100 tipos de reactivos de anticuerpos monoclonales de la serie CD antihumano de ratón, además de reactivos de anticuerpos monoclonales antihumanos de ratón y anticuerpos antihumanos de ratón. citoquinas Hay más de 300 tipos de reactivos de anticuerpos monoclonales, reactivos de anticuerpos monoclonales antifactor de crecimiento humano de ratón, reactivos de anticuerpos monoclonales de antígeno antitumoral relacionado con tumores humanos de ratón, reactivos de anticuerpos monoclonales antienzimáticos de ratón, monoclonales de filamento intermedio antihumano de ratón. reactivos de anticuerpos, etc. Actualmente, la mayoría de los anticuerpos monoclonales se derivan de ratones.
Los anticuerpos monoclonales derivados de ratón son una proteína heterogénea. Después de su uso en el cuerpo humano, el efecto terapéutico de los anticuerpos monoclonales a menudo se reduce debido a la producción de anticuerpos humanos anti-ratón e incluso pueden causar alergias. debido a la formación de reacciones de complejos inmunes y enfermedad del suero grave, lo que limita la aplicación terapéutica en humanos. Para superar las muchas deficiencias de los anticuerpos monoclonales de ratón, en los últimos años se han desarrollado anticuerpos monoclonales humanos mediante tecnología de hibridoma humano-ratón, tecnología de hibridoma humano-humano y tecnología de hibridoma de transformación EBV/transformación EBV.
En la actualidad, debido al lento crecimiento de las células de hibridoma obtenidas mediante el método anterior, el bajo nivel de secreción de anticuerpos, el rendimiento inestable y la fácil pérdida de clones positivos durante el paso, la preparación de anticuerpos monoclonales humanos se ha topado con muchas dificultades. dificultades, lo que resulta en que muchos estudios terapéuticos con anticuerpos monoclonales aún se encuentran en la etapa experimental. En los últimos 10 años, la investigación sobre anticuerpos modificados genéticamente se ha desarrollado rápidamente.
Los anticuerpos modificados genéticamente se refieren a moléculas de anticuerpos que utilizan ADN recombinante y tecnología de ingeniería de proteínas para modificar o reensamblar los genes del anticuerpo y transfectarlos en células receptoras apropiadas para su expresión. Las células receptoras comúnmente utilizadas para la transfección incluyen células de mieloma de ratón en sistemas de células eucariotas y Escherichia coli en sistemas de células procarióticas.
Los tipos de anticuerpos genéticamente modificados incluyen quimeras, anticuerpos modificados (heno, RAb), anticuerpos clonados procarióticos (anticuerpos oliclonales), anticuerpos fagos (phanti des), etc. En los últimos años, la investigación sobre anticuerpos modificados ha avanzado mucho.
Los anticuerpos modificados se construyen a partir de anticuerpos quiméricos. Los anticuerpos modificados utilizan tecnología de ingeniería genética para cambiar la secuencia determinante complementaria (CDR) de la región variable (V) del anticuerpo humano en la secuencia CDR de un anticuerpo monoclonal de ratón, reconstruyendo así un anticuerpo monoclonal de ratón con especificidad.
Los anticuerpos modificados también se denominan anticuerpos recombinantes (heno). Debido a que implican principalmente el trasplante de cDR, también se denominan anticuerpos trasplantados con cDR. Este anticuerpo modificado puede superar en gran medida la inmunogenicidad de los anticuerpos monoclonales de ratón en el cuerpo humano y tiene una alta especificidad y afinidad por el antígeno diana, por lo que tiene un gran valor práctico.
Existen muchas formas de construir anticuerpos modificados.
Actualmente, la tecnología de PCR se utiliza a menudo para construir anticuerpos modificados, como el método de superposición de mutaciones de PCR, que reemplaza la secuencia de CDR de ratón con la secuencia correspondiente en la región V humana. Después de varias rondas de amplificación por PCR, se puede obtener la secuencia de ensamblaje correcta. con alto rendimiento. La tecnología de PCR puede simplificar enormemente la construcción de anticuerpos modificados.
Se han construido más de 30 anticuerpos modificados dirigidos a diferentes antígenos, algunos de los cuales se han utilizado en diagnóstico y tratamiento clínico, y han conseguido resultados satisfactorios, como eliminar tumores y prolongar el tiempo de supervivencia de los trasplantes de órganos. los síntomas clínicos de vasculitis sistémica, artritis reumatoide, enfermedades infecciosas y trastornos inmunológicos, etc.
2. Antecedentes históricos del desarrollo de la ingeniería genética A principios de la década de 1970, se introdujeron genes de mamíferos en bacterias mediante experimentos de ADN recombinante y se expresaron con éxito, creando así la industria farmacéutica biotecnológica. En poco más de 20 años se han obtenido diversos fármacos biotecnológicos como la insulina humana, la hormona del crecimiento humano, el interferón-α y la interleucina-2. Ya está en el mercado. Desde 65438 hasta 0997, se aprobó la comercialización en los Estados Unidos de 39 medicamentos, vacunas y anticuerpos monoclonales inyectables genéticamente modificados. En 2004, había más de 150 tipos. Desde el nacimiento de la ingeniería genética en la década de 1970, la primera y más activa área de investigación ha sido la medicina. El rápido desarrollo de la tecnología de ingeniería genética ha permitido a las personas producir muchas sustancias biológicamente activas que antes eran difíciles de obtener en grandes cantidades.
3. ¿Cuáles son los desarrollos de la biología molecular? ¿El desarrollo de la biología molecular se puede dividir a grandes rasgos en tres etapas?
(1) Etapa de preparación y elaboración de cerveza 65438 El período comprendido entre finales del siglo XIX y principios de la década de 1950 fue la etapa de preparación y elaboración de cerveza para el nacimiento de la biología molecular moderna. En esta etapa se produjeron dos avances importantes en la comprensión de la naturaleza de la vida.
Las proteínas son la principal base material de la vida. A finales de 1919, los hermanos Buchner demostraron que el extracto libre de células de levadura podía fermentar el azúcar para producir alcohol y propusieron por primera vez el nombre de la enzima. Las enzimas son catalizadores biológicos.
Algunas enzimas (incluidas la ureasa, pepsina, tripsina, isozimas, citocromo c, actina, etc.) fueron purificadas y cristalizadas entre los años 1920 y 1940, demostrando que la esencia de la enzima es la proteína. Posteriormente se descubrió que muchos fenómenos básicos de la vida (metabolismo material, metabolismo energético, digestión, respiración, movimiento, etc.) están relacionados con enzimas y proteínas, y los experimentos in vitro se pueden repetir utilizando enzimas o proteínas purificadas.
Durante este período también se lograron grandes avances en la comprensión de la estructura de las proteínas. 1902 Emil Fisher demostró que la estructura de la proteína es un polipéptido; a finales de la década de 1940, Sanger creó el método DNFB y Edman desarrolló el método del isotiocianato de fenilo para analizar los aminoácidos N-terminales de la cadena peptídica. Sanger y Thompson completaron el análisis de la secuencia de aminoácidos de las primeras moléculas polipeptídicas, la cadena A de la insulina y la cadena B de la insulina, en 1953.
Debido al desarrollo de la tecnología de análisis de difracción de rayos X de cristales, Pauling y Corey propusieron el modelo de estructura helicoidal α de la queratina α en 1950. Por tanto, en esta etapa se ha reconocido la estructura primaria y la estructura espacial de la proteína.
El material que determina la herencia biológica es el ADN. Aunque los nucleidos fueron descubiertos por F. Miescher en 1868, durante el medio siglo siguiente no atrajeron la atención de la gente.
En las décadas de 1920 y 1930 se confirmó que en la naturaleza existen dos tipos de ácidos nucleicos, el ADN y el ARN, y se aclaró la composición de los nucleótidos. Debido a que el análisis cuantitativo de nucleótidos y bases en ese momento no era lo suficientemente preciso, se concluyó que los contenidos de A, G, C y T en el ADN eran aproximadamente iguales. Por eso, durante mucho tiempo, la gente creyó que la estructura del ADN era sólo una repetición de la unidad "tetranucleótido", sin diversidad y incapaz de transportar más información. En aquella época se consideraba que las proteínas eran candidatas más probables para transportar información genética.
Los hechos experimentales desde la década de 1940 han logrado grandes avances en la comprensión de la gente sobre la función y la estructura de los ácidos nucleicos.
1944 O.T. Avery et al. demostraron que el factor de transformación neumocócica es el ADN. El análisis de difracción de rayos X de Furbery et al. en 1952 aclaró que los nucleótidos no son imágenes espaciales planas y propusieron que el ADN es una estructura helicoidal; al. utilizó nuevas técnicas de cromatografía y electroforesis, analizó el número de bases y nucleótidos que componen el ADN, acumuló una gran cantidad de datos y propuso la ley de Chargaff de que la composición de las bases del ADN es A=T, G=C, lo que sentó las bases para Comprender la estructura del ADN de los pares de bases.
(2) La etapa de establecimiento y desarrollo de la biología molecular moderna es desde principios de la década de 1950 hasta principios de la década de 1970. El modelo de estructura de doble hélice del ADN propuesto por Watson y Crick en 1953 sirvió de base. biología molecular moderna. Un hito en el nacimiento de la ciencia, creando oro para el establecimiento y desarrollo de teorías básicas de la genética molecular. La importancia más profunda del descubrimiento de la doble hélice del ADN es que estableció la base estructural de los ácidos nucleicos como moléculas de información y señaló que el emparejamiento de bases es la forma básica de replicación de los ácidos nucleicos y transmisión de información genética. Así, finalmente se determinó que los ácidos nucleicos son la base material de la herencia, sentando las bases más importantes para comprender la relación entre los ácidos nucleicos y las proteínas y su papel en la vida.
Los principales avances durante estos períodos incluyen: El establecimiento del dogma central de la transmisión de información genética. Cuando Watson y Crick descubrieron la estructura de doble hélice del ADN, propusieron un posible modelo para la replicación del ADN.
Luego, la ADN polimerasa fue descubierta por primera vez por A. Kornbery en 1956; el etiquetado de isótopos de Meselson y Stahl y los experimentos de ultracentrifugación en 1958 demostraron el modelo de semi-retención del ADN. En 1968, Okazaki propuso el modelo de replicación discontinua del ADN; en 1972, se confirmó que la replicación del ADN requiere ARN como cebador; a principios de la década de 1970 obtuvo la ADN topoisomerasa y analizó las características de la ADN polimerasa eucariota; Estos han mejorado gradualmente nuestra comprensión del mecanismo de replicación del ADN. Al estudiar la transmisión de información genética desde la replicación del ADN a la descendencia, este artículo propone la hipótesis de que el ARN desempeña un papel mediador en el proceso de transmisión de información genética a las proteínas.
1958 Weiss y Hurwitz descubrieron la ARN polimerasa dependiente de ADN; en 1961, Hall y Spiegel-Mann utilizaron la heterocromía ARN-ADN para demostrar que las secuencias de ARNm y ADN son complementarias. Los mecanismos de transcripción y síntesis de ARN se aclaran gradualmente. Reconoce también que las proteínas se sintetizan recibiendo información genética del ARN.
A principios de la década de 1950, Zameik et al. descubrieron a través de la morfología y experimentos sobre el aislamiento de componentes subcelulares que los microsomas son el sitio de síntesis de proteínas intracelulares. En 1957, Hoogland, Zamek y Stephenson aislaron el ARNt y propusieron una hipótesis funcional para el transporte de aminoácidos en la síntesis de proteínas. En 1961, Brenner y Gross observaron la unión del ARNm y los ribosomas durante la síntesis de proteínas. En 1965, Holley determinó por primera vez la estructura primaria del ARNt de alanina de levadura; especialmente en la década de 1960, varios grupos de científicos como Nirenberg, Ochoa y Kolanna hicieron grandes esfuerzos para descifrar el código genético para la síntesis de proteínas. Investigaciones posteriores demostraron que este código genético es ubicuo en el mundo biológico, comprendiendo así los procesos básicos de traducción y síntesis de proteínas. Los importantes descubrimientos mencionados anteriormente establecieron un sistema teórico básico de genética molecular basado en el dogma central.
En 1970, Temin y Baltimore también descubrieron la transcriptasa inversa que sintetiza ADN a partir de partículas de virus del tumor de pollo utilizando ARN como plantilla, complementando y mejorando aún más el dogma central de la transmisión de información genética. Obtenga más información sobre la estructura y función de las proteínas.
En 1956-58, Anfinsen y White propusieron que la estructura tridimensional de una proteína está determinada por su secuencia de aminoácidos basándose en experimentos de desnaturalización y renaturalización de proteínas enzimáticas.
En 1958, Ingram demostró que sólo hay un residuo de aminoácido en la cadena peptídica de la subunidad entre la hemoglobina normal y la hemoglobina de pacientes hemolíticos falciformes, lo que dejó a la gente profundamente impresionada por el impacto de la estructura primaria de las proteínas en la función.
Al mismo tiempo, también se han mejorado los métodos de investigación de proteínas. En 1969, Weber comenzó a utilizar la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS para determinar el peso molecular de las proteínas. En la década de 1960 se analizaron sucesivamente las uniones primarias de varias proteínas, como la hemoglobina y la ribonucleasa A.
4. Una breve historia del desarrollo de los agentes biológicos; las etapas de desarrollo de la biotecnología tradicional.
En el año 6000 a.C., los sumerios elaboraban cerveza
En el año 4000 a.C., los egipcios fermentaban pan
En China, la salsa de soja se elaboraba en la dinastía Yin. Sí, El vinagre se elaboraba en la dinastía Zhou...
Características: Fermentación natural, todo basado en la experiencia.
Etapa de la biotecnología moderna
En 1673, el microbiólogo holandés Antony Leeuwenhoek inventó un microscopio sencillo de alta potencia (300 aumentos) y descubrió los microorganismos.
En 1857, el científico francés Pasteur demostró el principio de la fermentación.
La penicilina fue descubierta por Fleming en Inglaterra en 1928.
La penicilina se aisló de las cadenas británicas de Flory y Ernst Boris en 1940.
Biotecnología moderna
1953 Estructura de doble hélice del ADN
1973 Establecimiento de la tecnología de ADN recombinante
1975 Establecimiento de la tecnología de anticuerpos monoclonales
1978 Expresión de insulina por E. coli.
1988 Aparece la tecnología PCR.
1997 Oveja británica clonada Dolly.
Tecnología de interferencia de ARN de 1998
5. El desarrollo de anticuerpos monoclonales completamente humanizados ha pasado por anticuerpos monoclonales de ratón, anticuerpos monoclonales quiméricos y anticuerpos monoclonales humanizados. Cuatro etapas de anticuerpos clonales y completamente. Anticuerpos monoclonales humanizados.
Anticuerpos monoclonales totalmente humanos: Las regiones variables y constantes del anticuerpo son humanas, eliminando inmunogenicidad y efectos secundarios tóxicos. Las tecnologías relacionadas con la preparación de anticuerpos totalmente humanos incluyen principalmente: tecnología de hibridoma humano, tecnología de linfocitos B transformados con EBV, tecnología de presentación en fagos, tecnología de preparación de anticuerpos de ratón transgénico y tecnología de preparación de anticuerpos de células B individuales.
Los medicamentos con anticuerpos humanizados y completamente humanizados preparados a partir de anticuerpos humanizados y completamente humanizados tienen las características de alta afinidad, alta especificidad y bajos efectos tóxicos y secundarios, lo que supera los desafíos de los anticuerpos de origen animal y los anticuerpos quiméricos. Las deficiencias de los anticuerpos se han convertido en una tendencia inevitable en el desarrollo de fármacos terapéuticos con anticuerpos. Como fármaco biológico de anticuerpos monoclonales, el adalimumab es difícil de cuestionar en términos de eficacia y umbral técnico; además, cada vez más médicos prefieren formas farmacéuticas de inyección subcutánea cuando tratan enfermedades reumatoides, que no requieren procedimientos ni costos de inyección. Aunque aún no se han publicado ensayos clínicos comparativos con etanercept, en general se considera que adalimumab es más eficaz.