Investigación proteómica clínica del cáncer basada en espectrometría de masas

Los biomarcadores tumorales son actualmente el foco de la investigación clínica del cáncer. Por lo tanto, es necesario explorar y verificar continuamente nuevos biomarcadores en el diagnóstico temprano, la clasificación del riesgo y la detección de la respuesta del paciente al tratamiento. Se han descubierto muchos marcadores útiles en estudios del genoma y del transcriptoma, pero los cambios en la expresión de proteínas reflejan mejor los cambios en la fisiopatología del tumor. En el pasado, el diagnóstico clínico se basaba en varios métodos basados ​​en la detección de anticuerpos, pero estos métodos tienen limitaciones. La espectrometría de masas es un método potente que permite comprender plenamente los cambios en el proteoma, facilitando así el desarrollo de una medicina personalizada. Este artículo se centrará en la oncología, presentará el progreso de la investigación de la proteómica clínica basada en la tecnología de espectrometría de masas y proporcionará una descripción detallada de la preparación de muestras clínicas, los métodos de detección cuantitativa de proteínas, la configuración de la espectrometría de masas y el análisis de datos. Además, la creciente sensibilidad de la tecnología de espectrometría de masas ha llevado a la aparición de nuevas formas de marcadores proteicos específicos de tumores, como modificaciones postraduccionales y variaciones derivadas de aberraciones genómicas. Estos avances no sólo consolidan la posición de la proteómica clínica basada en la espectrometría de masas en la investigación del cáncer, sino que también aceleran su desarrollo hacia el análisis de rutina y la práctica clínica.

Métodos de preparación de muestras clínicas

Para la investigación clínica de tejidos, los métodos de conservación correctos son muy importantes para garantizar la calidad de las proteínas desde la resección quirúrgica hasta la proteólisis. Hay varios métodos para elegir: fresco congelado (FF), fijado con formalina e incluido en parafina (FFPE) y OCT incluido. En comparación con el FFPE, el FF puede detectar más proteínas, pero el FFPE existente se ha almacenado durante varios años o incluso más de diez años y es una fuente importante de muestras para el seguimiento clínico y otros estudios retrospectivos. Mientras que los estudios de proteómica tisular pueden explorar información sobre mecanismos biológicos, los estudios de proteómica clínica tienen como objetivo encontrar nuevos biomarcadores, por lo que las muestras de "fluidos corporales" como sangre (suero, plasma), orina, saliva, lágrimas y líquido cefalorraquídeo son ideales. El formato de la muestra también puede utilizarse para estudios longitudinales de detección del cáncer y desarrollo de la respuesta al tratamiento. Cuando la calidad de las muestras clínicas es insuficiente para respaldar la investigación, se pueden considerar sistemas modelo como modelos animales transgénicos, líneas celulares cancerosas, modelos de xenoinjertos (CDX, PDX) y modelos organoides.

No existe un protocolo unificado para la preparación de muestras de proteómica. Se deben seleccionar y optimizar métodos apropiados en función de la complejidad, el tamaño de la muestra y el propósito de la investigación. Los principales métodos de preparación son FASP, MStern, S-trap, SP3 e iST. Aquí, FASP se utiliza como ejemplo de introducción. FASP es un método de preparación de muestras asistido por filtración que primero solubiliza las proteínas con el tensioactivo aniónico dodecilsulfato de sodio (SDS) y luego une las proteínas a filtros de nitrocelulosa mediante filtración de peso molecular (MW). El lavado continuo de urea ayuda a eliminar mejor el SDS y finalmente se obtiene el producto peptídico mediante proteólisis y elución en el filtro.

El principio y el proceso de detección por espectrometría de masas

Para aumentar la cobertura del proteoma durante el proceso de detección, la muestra de péptido se divide primero en diferentes fracciones mediante un líquido de fase reversa. cromatografía y luego ingresa al análisis MS. Al utilizar la tecnología de ionización suave (ESI o MALDI) para ionizar péptidos, los péptidos atomizados se pueden separar aún más mediante la movilidad iónica, reduciendo así la complejidad de la espectrometría de masas primaria (MS1) y la contaminación de la espectrometría de masas secundaria (MS2) y, en última instancia, logrando una cobertura de proteoma grande más precisa. Estas técnicas incluyen movilidad iónica (TIMS) y espectroscopia sumatoria de movilidad iónica de alto campo (FAIMS). En cuanto a la elección del modo de escaneo de espectrometría de masas, el modo tradicional de adquisición dependiente de datos (DDA) ha sido muy maduro en la investigación proteómica y es compatible con la tecnología cuantitativa basada en etiquetas. En DDA, los N iones precursores superiores con las señales más fuertes en el escaneo MS1 se seleccionan y se someten a fragmentación secuencial y detección de MS2. Sin embargo, la reproducibilidad de la detección de este modelo es pobre y existe el problema de que los péptidos de alta abundancia en MS1 ​​afectan la detección de péptidos de baja abundancia. Debido a las deficiencias de DDA, los estudios proteómicos tienden a utilizar el modo DIA. En este modo, la fragmentación secuencial de todos los iones precursores en múltiples ventanas de relación masa-carga de rango pequeño produce resultados MS2 más complejos.

Luego, estos resultados se comparan con bibliotecas espectrales predefinidas para lograr la máxima profundidad del proteoma mediante una amplia combinación de péptidos.

Métodos de detección cuantitativa de proteínas

Existen muchos tipos de tecnologías de detección cuantitativa de proteínas. Se pueden dividir en tecnologías dirigidas y no dirigidas según el rango de detección. dividirse en tecnologías relativas según los métodos cuantitativos o técnicas cuantitativas absolutas. Entre ellas, las tecnologías cuantitativas relativas se pueden dividir en tecnologías etiquetadas (TMT e iTRAQ) y tecnologías no etiquetadas (sin etiqueta, DIA). Etiquetar etiquetas TMT con técnicas de cuantificación relativa puede aumentar el rendimiento de la muestra a 16. Sin embargo, los métodos TMT requieren múltiples niveles de fraccionamiento de péptidos para obtener perfiles de proteínas detallados, y normalmente se utilizan 1-2 canales TMT para detectar muestras agrupadas de todas las muestras para reducir la variación entre lotes, lo que reduce la capacidad de comparar eficazmente. entre proyectos, aumentando el coste de detección. Con el desarrollo de software de análisis de datos, la tecnología sin etiquetas puede calcular la abundancia relativa de proteínas a partir de la fracción máxima de iones peptídicos de MS1. En comparación con la tecnología de marcadores, la tecnología sin marcadores tiene un rango dinámico más amplio pero una precisión ligeramente menor. Por lo tanto, para muestras clínicas con grandes diferencias en la expresión de proteínas entre y dentro de los pacientes, las técnicas cuantitativas sin etiquetas son más adecuadas para identificar proteínas expresadas de manera más diferencial.

La proteína diana analizada mediante tecnología de detección cuantitativa relativa no dirigida requiere verificación de expresión, como ELISA basada en anticuerpos y tecnología de análisis dirigida basada en MS. Entre ellas, hay dos tecnologías cuantitativas específicas basadas en espectrometría de masas: detección de reacciones múltiples (MRM) y detección de reacciones paralelas (PRM). MRM se analizó mediante un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo. Es necesario determinar primero la relación masa-carga del ion precursor objetivo y de los iones fragmentados, y luego el cuadrupolo selecciona una combinación del ion precursor y 3-5 iones fragmentados relacionados para el análisis cuantitativo. PRM utiliza espectrometría de masas de alta resolución para aumentar la especificidad. Todos los iones fragmentados en PRM se generan y registran durante el análisis, por lo que solo necesita determinar la relación masa-carga del ion principal objetivo y seleccionar directamente los mejores iones fragmentados del espectro de masas secundario para el análisis cuantitativo. Ambas tecnologías de focalización pueden alcanzar niveles de cuantificación absolutos si se añaden como controles estándares de péptidos marcados con isótopos estables. PRM puede monitorear de manera confiable más objetivos que cualquiera de las dos tecnologías.

Direcciones de aplicación de la proteómica clínica

En la investigación oncológica, el análisis de tejidos puede reflejar con mayor precisión el estado fisiológico de los tumores, descubrir biomarcadores y vías biológicas y analizarlos. Combinarlos con la genómica y la transcriptómica existentes. resultados para realizar análisis multigrupo. Estos estudios suelen utilizar muestras de tejido canceroso del mismo paciente para compararlas con muestras de control "sanas" de cánceres adyacentes para encontrar posibles biomarcadores de diagnóstico. Al mismo tiempo, se obtiene información pronóstica comparando pacientes con diferentes estadios del cáncer. Después de identificar una pequeña cantidad de proteínas candidatas, se puede utilizar el análisis de rutas para obtener una comprensión más profunda de la relación entre estas proteínas y los procesos que impulsan el cáncer, como la tumorigénesis, la proliferación y la metástasis, y luego complementarse con experimentos de verificación de proteínas expresadas diferencialmente. en muestras independientes a gran escala. Para resumir el estado actual de la investigación científica, las direcciones de investigación de la proteómica del cáncer incluyen principalmente la búsqueda de predicciones de riesgo, clasificación del cáncer y marcadores de pronóstico, identificación de objetivos terapéuticos eficaces y modificaciones postraduccionales como la fosforilación, acetilación y glicosilación. Además, la cuestión de la heterogeneidad tumoral requiere estudios de proteínas a nivel unicelular. La tecnología de flujo de masas basada en espectrometría de masas puede monitorear docenas de marcadores de proteínas en células individuales. Se adjuntan sondas de anticuerpos con isótopos de metales pesados ​​únicos y se incuban con las células. Luego, las células se atomizan con plasma acoplado inductivamente (ICP) y los iones metálicos se eliminan. El espectrómetro de masas proporciona una lectura cuantitativa de la proteína objetivo en la muestra.

En el artículo "Caracterización proteómica integrada del carcinoma hepatocelular relacionado con el VHB" publicado en "Cell" en junio de 2019, el autor adoptó la idea de una investigación multigrupo. Se estudió el genoma, transcriptoma, proteoma y fosfoproteoma de 159 pacientes con infección por el virus de la hepatitis B. Se descubrió el impacto de los cambios metabólicos en el desarrollo tardío y el mal pronóstico del carcinoma hepatocelular, y el carcinoma hepatocelular se clasificó con precisión a nivel de proteínas, lo que proporcionó una nueva estrategia para la terapia dirigida personalizada.

Perspectivas de la investigación en proteómica clínica

Con el desarrollo continuo de la estandarización y la tecnología proteómica basada en Qualcomm, la investigación clínica avanzará hacia cohortes más grandes, lo que permitirá que los resultados de los estudios proteómicos sean más estadísticamente significativo y mejorar la eficiencia de la traducción clínica de marcadores de proteínas y objetivos farmacológicos. Por otro lado, la proteómica se convertirá en una parte importante de la biología de los sistemas cancerosos al integrar la genómica, la epigenómica, la transcriptómica y la genómica de modificación postraduccional.

Referencias

Avances recientes en proteómica clínica basada en espectrometría de masas: aplicaciones en la investigación del cáncer. Proteómica clínica Volumen 17. 24 de mayo. 2020.

Zhang, Yao Y. et al., "Análisis de proteínas mediante escopeta/proteómica ascendente" Chemical Reviews Volumen 113, 4 (2013): 2343-94.

Gao, Qiang et al., Célula de investigación proteómica del cáncer de hígado 179, 2(2019): 561-577.