Electroforesis de máxima resolución
La electroforesis de mayor resolución es la electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida.
La electroforesis en gel de poliacrilamida es una técnica de electroforesis de uso común que utiliza gel de poliacrilamida como medio de soporte. A menudo se utiliza para separar oligosacáridos y proteínas. A menudo se usa como detergente aniónico y puede usarse como agente disolvente y agente de deformación. La función del gel apilable se menciona a menudo en la función del gel apilable. Cuando la concentración es relativamente pequeña, el tamaño de los poros será relativamente grande.
Principio de acción: el gel de poliacrilamida tiene una estructura de red y tiene un efecto de tamiz molecular. Viene en dos formas: PAGE nativa y gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE).
En el gel de poliacrilamida no desnaturalizante, durante el proceso de electroforesis, las proteínas pueden permanecer intactas y separarse gradualmente en un gradiente basado en el peso molecular de la proteína, la forma de la proteína y la cantidad de carga unida a ella. él.
SDS-PAGE puede separar proteínas basándose únicamente en la diferencia en el peso molecular de las subunidades de proteínas. Esta técnica fue establecida originalmente en 1967 por Shapiro, quien descubrió que después de agregar un detergente iónico y un agente reductor fuerte (SDS, dodecilsulfato de sodio) al medio de muestra y al gel de acrilamida, la movilidad electroforética de las subunidades de proteínas dependía principalmente de la estructura molecular. peso de las subunidades.
Función:
SDS es un detergente aniónico. Como agente desnaturalizante y disolvente, puede romper los enlaces de hidrógeno dentro y entre las moléculas, desplegar las moléculas y destruir proteínas secundarias y. estructuras terciarias de moléculas. Los agentes reductores fuertes como el mercaptoetanol y el ditiotreitol pueden romper los enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína.
Después de agregar agente reductor y SDS a la muestra y al gel, las moléculas se despolimerizan en cadenas polipeptídicas. Las cadenas laterales de aminoácidos despolimerizadas y el SDS se combinan en micelas de proteína-SDS, que tienen una carga negativa muy grande. excede Se elimina la carga original de la proteína, eliminando así las diferencias de carga y las diferencias estructurales entre diferentes moléculas.
SDS-PAGE generalmente utiliza un sistema de búfer discontinuo, que puede alcanzar una resolución más alta que un sistema de búfer continuo.
La función del gel de apilamiento es acumular. La concentración del gel es pequeña y el tamaño de los poros es grande. La muestra diluida se agrega al gel de apilamiento y se concentra a una concentración mediante la migración del gel de apilamiento. Gel de tamaño de poro. Al seleccionar la solución de muestra y el gel de apilamiento, seleccione el tampón TRIS/HCI y seleccione TRIS/glicina para la solución del electrodo.
Después de que comienza la electroforesis, el HCl se disocia en iones de cloruro y la glicina se disocia en una pequeña cantidad de iones de glicina. Las proteínas están cargadas negativamente, por lo que se mueven juntas hacia el polo positivo, siendo los iones cloruro los más rápidos, los iones glicinato los más lentos y las proteínas en el medio.