Las células primarias están separadas y el tejido es pegajoso y no puede ser digerido por las células.
1. Selección de la edad de las ratas recién nacidas. Los cardiomiocitos de las ratas recién nacidas se encuentran en el 3er. un año después del nacimiento tiene capacidad de proliferación parcial en cuestión de días, mientras que los cardiomiocitos de las ratas adultas son células terminalmente diferenciadas y ya no tienen la capacidad de dividirse y proliferar. Por lo tanto, cuanto más baja sea la rata, mayor será la tasa de supervivencia de sus cardiomiocitos después del aislamiento y más fácil les resultará crecer en la pared. Un gran número de observaciones han demostrado que lo ideal es aislar cardiomiocitos de ratas de 1 a 3 días para el cultivo primario, especialmente en ratas de medio día.
2 Selección y uso de enzimas digestivas
El método de bloqueo de tejido y el método de digestión se pueden utilizar para aislar cardiomiocitos de rata neonatal. El primero rara vez se utiliza debido a la dificultad de obtener células con densidad uniforme y controlar el crecimiento de fibroblastos. Hay tres enzimas comúnmente utilizadas en los métodos de digestión: tripsina, colagenasa I o II y hialuronidasa. La hialuronidasa se utiliza a menudo en combinación con tripsina o colagenasa. La tripsina tiene un efecto fuerte y puede dañar fácilmente las células del miocardio. La colagenasa tiene un efecto leve. Puede digerir las fibras de colágeno en el espacio intercelular y liberar células, causando poco daño a las células. Además, el colágeno tipo I es el tipo principal en el tejido miocárdico de las ratas recién nacidas, por lo que elegimos la colagenasa tipo I. Se ha informado del trabajo de la colagenasa. en la literatura. ¿La concentración es generalmente de 0,6 a 1 g? L1, utilizamos 0,8 g? L1. La colagenasa está mejor preparada ahora.
3. Captar la digestibilidad
Los cardiomiocitos neonatales de rata son extremadamente sensibles a la digestión enzimática, lo que puede provocar la contracción de las miofibrillas, un aumento de la muerte celular o la pérdida de la capacidad de adhesión y pulsación. Cuando no se digieren lo suficiente, las células se agrupan y los límites celulares son difíciles de distinguir, lo que dificulta la observación morfológica. Cuando se utiliza un agitador magnético durante el proceso de digestión, se debe prestar atención a 1) ¿La velocidad de rotación generalmente se controla entre 60 y 80 r? Alrededor de Min1. (2) El tiempo de cada digestión deberá determinarse en función de la concentración de enzimas digestivas. (3) Sople el tejido miocárdico adherido al mezclador para asegurar un contacto total entre la solución enzimática y el tejido. (4) La temperatura adecuada es 35~37 ℃. (5) Cuando el tejido cambia de rojo a blanco y se vuelve translúcido, se debe detener la digestión.
4 La densidad de las células sembradas
La densidad de siembra de los cardiomiocitos no solo afecta el contacto entre las células, lo que a su vez afecta la respuesta celular a la estimulación hipertrófica, sino que también afecta la tasa de supervivencia. de células cultivadas a largo plazo. El número absoluto de células sembradas debe calcularse con precisión. En términos generales, el número de células por unidad de área debe determinarse de acuerdo con el propósito de observación del experimento. Por ejemplo, para la observación morfológica, el número de células sembradas en cada pocillo de una placa de seis pocillos debe controlarse en 1×105 ~ 2×65438. Si es necesario recolectar cardiomiocitos para observar los niveles de expresión de ARNm o proteínas, la densidad de siembra de cada pocillo se puede aumentar a 5×105~6×105.