Anticuerpo monoclonal combinado con tecnología de clonación de genes

1.1 Materiales

1.1.1 Células y cepas HAb18 es una línea celular de hibridoma de ratón que secreta anticuerpos monoclonales contra el cáncer de hígado humano. Fue establecida por Chen Zhinan [4. ]; normal La línea celular de hígado QZG se obtuvo del Banco de Células de Shanghai de la Academia de Ciencias de China. El vector de clonación y expresión PCANTAB 5E son productos de Pharmacia.

1.1.2 El sistema de transcripción inversa del reactivo es un producto de los cebadores de PCR de Promega Company: cebadores de cadena pesada 1 y 2 (2 (producto de Pharmacia Company)), que son cebadores en el extremo 5' y extremo 3' de la cadena pesada respectivamente; mezcla de cebadores de cadena ligera: una mezcla de 10 cebadores en el extremo 5' y el extremo 3' de la cadena ligera, utilizada para amplificar el gen VL de Ig de ratón; la mezcla de cebadores adaptadores es el 3'; extremo de la cadena pesada y la cadena ligera de la secuencia adaptadora (Gly4Ser) 3. Los cebadores en el extremo 5' se usan para empalmar VH y VL en el gen ScFv; la mezcla de cebadores RS es una mezcla de cebadores 5' de cadena pesada con SfiI; sitios y cebadores 3' de cadena ligera con sitios NotI, utilizados para amplificar el fragmento del gen ScFv e introducir sitios de restricción. Los cebadores A y D son el cebador 5' de cadena pesada (que contiene el sitio de restricción EcoRI) y el cebador 3' de cadena ligera (que contiene SalI). sitio de restricción) [5]. La secuencia es la siguiente:

Primer A VH-1 (adelante):

5′gtgaattcatgcagggtgcagctgttggagttgg 3′

EcoR<. /p>

Primer D VL-2 (reverso):

5′cagtcgacttacgtttgatctcagcttggtccc 3′

Sal

1.2 Método

1.2.1 Extracción de ARN total, 1 síntesis de ADNc, amplificación de genes VH y VL Utilice células HAb18 en la fase de crecimiento logarítmico y utilice el método de desnaturalización con isotiocianato de guanidinio para extraer el ARN total de las células según las instrucciones del producto. Sistema de transcripción inversa de la empresa Promega. Sintetizar la primera cadena de ADNc. Divida la reacción de síntesis de la primera cadena de ADNc en dos partes y agregue 2 µl de cebadores VH y VL para PCR. VH y VL recuperados del 1.2.2 ScFv. ensamblaje del gen Los fragmentos del gen se mezclaron con la mezcla de cebador adaptador en moles iguales, se agregaron dNTP a una concentración final de 2,5 mmol/l y se usó Taq ADN polimerasa 5u durante 7 ciclos de PCR (94 °C durante 1 minuto, 63). °C durante 4 minutos) para empalmar los genes VH y VL en el gen ScFv. En el sistema de reacción anterior, después de agregar la mezcla de cebador RS y 30 ciclos de PCR, se pueden agregar sitios de restricción SfiI y NotI a ambos extremos del ScFv. gen.

1. 2. 3. Clonación y cribado del gen ScFv. El producto de la PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,8% y luego se recuperó la emulsión de vidrio con SfiI y NotI. y luego se ligó con el ADN del fagémido pCANTAB 5E digerido por estas dos enzimas y se transformó en E. coli HB2151. Se transformó en SOBAG. Se tomó una sola colonia de la placa de transformación y se cultivó en 2xYTAG (medio 2xYT que contiene 65,438). +000 mg/L de ampicilina y 2% de glucosa) a 30°C durante la noche. Se extrajo una pequeña cantidad de ADN del fagémido mediante lisis alcalina y el fragmento del gen ScFv se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores A y D y se clonó en el vector pUC19.

1.2.4 La secuencia de nucleótidos de ScFv se determinó mediante el analizador de secuencia automático americano PE317-A.

Expresión secretora del gen ScFv soluble 1.2.5 Inocular el fagémido recombinante que contiene el gen ScFv en 5 ml de medio LB y cultivarlo durante la noche. Añadir 50 ml de SBAG (medio de cultivo SB que contiene 65438 ± 000 mg/l de ampicilina y 2 % de glucosa), incubar con agitación a 30 °C durante 65438 ± 0 h, centrifugar a 5000 r/min durante 65438 ± 05 min y desechar el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en 50 ml de SBAI (medio SB que contenía 100 mg/l de ampicilina y 1 mmol/l de IPTG), se indujo a 37°C durante 3 horas y se centrifugó como anteriormente.

Suspender el sedimento en 5 ml de lisozima recién preparada (1 g/l), sacarosa al 20 % (p/v), solución de Tris-Cl (pH 8,0) 30 mmol/l y EDTA 1 mmol/l (pH 8,0). e incubar en hielo a 4°C durante 10 minutos para obtener 65438. Después de la liofilización, conservar a -20°C. Disuélvalo en PBS 0,01 mol/l hasta 500 μl.

SDS-PAGE y Western blot identifican el producto de expresión soluble del gen 1.2.6 ScFv (el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-E-tag de ratón) .

1.2.8 Análisis de la actividad de anticuerpos monocatenarios mediante citometría de flujo. Se recogieron y cultivaron células de cáncer de hígado SMMC 7721, células de hígado normales QZG y células de cáncer gástrico SCG 7901, y la concentración celular se ajustó a 5 x 106/l con FCS RPMI1640 al 10%. Agregue 40 µl de suspensión celular y 100 µl de producto de expresión de ScFv a cada tubo de ensayo, luego agregue 50 µl de suero de conejo normal inactivado (diluido con DPBS), incube a 4°C durante 30 minutos, lave dos veces y centrifugue a 800 r. /min. 5 min, descartar el sobrenadante. Agregue 8 µl (2,5 g/l) de anticuerpo anti-E-tag, reaccione a 4 °C durante 30 minutos, lave dos veces y deseche el sobrenadante. Agregue 50 l de anticuerpo anti-ratón de cabra marcado con FITC, agite bien, incube a 4 ° C durante 30 minutos, lave dos veces, agregue 500 l de fijador y analice con citometría de flujo. Al mismo tiempo, las células hepáticas normales y las células cancerosas gástricas se establecieron como grupos de control negativo, y las células cancerosas de hígado más el anticuerpo parental Hab18 se establecieron como grupos de control positivo.

2 Fructificación

2.1 La amplificación por PCR de los genes VH y VL y el corte y empalme del gen ScFv mostraron que los genes VH y VL tenían 363 pb y 342 pb respectivamente, lo que era consistente con el VH esperado. y VL Los fragmentos del gen son del mismo tamaño. Los genes VH y VL están conectados al gen ScFv a través de un conector (el conector tiene 45 pb). Usando esto como plantilla, se añadió la mezcla de cebadores RS para la amplificación por PCR. El tamaño del producto amplificado fue de aproximadamente 730 pb, lo que indica que las concentraciones de las mezclas de cebadores VH, VL y adaptador eran precisas, y los sitios de corte de las enzimas SfiI y NotI. se introdujeron (Figura 1, consulte el Capítulo 1, página ⅳ).

2.2 Clonación del gen ScFv Clonar el gen ScFv en pCANTAB 5E y transformar el enlazador en E. coli HB2151. Las colonias transformadas se seleccionaron en medio sólido SOBAG. Luego se seleccionaron aleatoriamente 8 colonias, se preparó una pequeña cantidad de ADN fagémido y se identificaron usando Sfi I y NotI. Si hay una inserción extraña, se debe cortar un fragmento de aproximadamente 730 pb. Los resultados mostraron que los 8 clones contenían insertos.

2.3 La secuenciación del gen ScFv se muestra en la Figura 2. La longitud total del gen ScFv es de 726 pb, incluidos los genes VH, VL esperados y las secuencias enlazadoras. La secuencia del gen VH está situada aguas arriba del adaptador y la secuencia del gen VL está situada aguas abajo del adaptador.

2.4 Identificación de la proteína ScFv soluble El Mr esperado de la proteína de fusión ScFv-etiqueta E soluble es 29 000. E-tag se puede utilizar como etiqueta proteica para detectar la expresión del gen ScFv a través del anticuerpo anti-E-tag de ratón. Los clones positivos se indujeron con 65.438+0 mmol/l de IPTG durante 3 h, y se lisaron las células inducidas y no inducidas por IPTG. Después de SDS-PAGE, hubo una nueva banda de proteína obvia en (Mr = 29000), que era consistente con el tamaño previsto de la proteína de fusión ScFv-E-tag (Mr = 29000) (Figura 3, consulte la página ⅳ). Se realizaron al mismo tiempo la misma SDS-PAGE y Western blot que en la Figura 3. Había una banda coloreada en Mr de 29 000, que era una proteína ScFv soluble que podía unirse específicamente al anticuerpo anti-E-tag (Figura). 4, ver página ⅳ) .

2.5 Determinar la actividad de unión de la proteína ScFv soluble a las células de cáncer de hígado mediante citometría de flujo, en la que la proteína ScFv soluble se usa como primer anticuerpo, el anticuerpo anti-E-tag se usa como segundo anticuerpo y La IgG anti-ratón FITC se utiliza como anticuerpo terciario (Figura 5, consulte la página iv). Grupo de células de cáncer de hígado: anticuerpo irrelevante (anti-CD3) fue del 1,6 %, el anticuerpo parental fue del 97,5 %, ScFv fue del 30,9 %; células hepáticas normales + proteína ScFv fue del 2,6 %, células de cáncer gástrico + proteína ScFv fue del 4,1 %.

Los resultados mostraron que la proteína ScFv soluble podría unirse específicamente a las células de cáncer de hígado, pero no a las células de hígado normales ni a las células de cáncer gástrico. La microscopía de fluorescencia mostró que la proteína ScFv soluble estaba unida al antígeno de membrana de las células de cáncer de hígado y la fluorescencia granular era visible en la membrana celular (no se muestran los resultados).

3 Discusión

Con la investigación en profundidad sobre la estructura y función de los genes Ig y el surgimiento y madurez de nuevas tecnologías de ingeniería genética, la investigación sobre anticuerpos genéticamente modificados ha logrado grandes avances. progreso. En la actualidad, varios tipos de anticuerpos modificados genéticamente han superado básicamente las deficiencias de los anticuerpos monoclonales de ratón y la dificultad de preparar anticuerpos humanos, y se han utilizado ampliamente en la investigación médica básica y en el diagnóstico, tratamiento y prevención de enfermedades clínicas, especialmente el tratamiento de tumores. Ha entrado en la fase III de aplicación clínica. El uso de tecnología recombinante de ingeniería genética para reemplazar las regiones estructurales de las regiones constantes y variables de anticuerpos de ratón con fragmentos de anticuerpos humanos puede reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y aliviar eficazmente el rechazo inmunológico [6]. El uso de tecnología de mutación genética para cambiar ciertas estructuras de anticuerpos puede mejorar la afinidad del anticuerpo y extender su vida media [7]. Además, los genes de los anticuerpos se pueden conectar con otros genes funcionales para otorgarles nuevas funciones a los anticuerpos.

La tecnología de clonación de bibliotecas de anticuerpos desarrollada en los últimos años no requiere fusión celular ni siquiera inmunización, y puede obtener directamente los anticuerpos necesarios contra los antígenos correspondientes a nivel genético. La clave para preparar anticuerpos modificados genéticamente es obtener el gen de la región variable del anticuerpo, unirlo en un gen de anticuerpo monocatenario y expresar el producto biológicamente activo.

Este artículo utiliza tecnología RT-PCR para clonar el gen de la región variable del anticuerpo a partir de células de hibridoma (HAb18) que secretan anticuerpos monoclonales contra el cáncer de hígado. La clave está en el diseño de los cebadores de PCR. Los cebadores diseñados y sintetizados por la mayoría de los investigadores generalmente están diseñados para la secuencia conservada (o péptido señal) en el extremo 5' de fr 1 en la región V y la secuencia del extremo 3' del gen J (o la secuencia del gen de la región constante). y no son lo suficientemente específicos como para amplificar eficazmente algunos genes diana. Los cebadores mixtos del sistema de presentación en fagos de Pharmacia están diseñados para apuntar a secuencias de diferentes familias de genes de Ig de ratón. Teóricamente aplicable a todos los tipos de Ig, cada gen de región variable se puede amplificar, lo cual es muy importante para construir una biblioteca de anticuerpos completa.

El PCANTAB 5E utilizado en este estudio es un producto de Pharmacia Company y contiene un gen de resistencia a la ampicilina, un promotor plac y un fragmento espaciador del gen del fago M13. Hay una secuencia de etiqueta c-myc y una etiqueta de código de parada de color ámbar entre el sitio de clonación múltiple y la región codificante G ⅲ. IPTG puede inducir la expresión de genes extraños. En las cepas sin genes supresores ámbar (como HB2151), se reconoce el código de terminación después de la etiqueta E y la traducción de la cadena polipeptídica se detiene aquí, lo que produce una cepa biológicamente activa con liberación en el periplasma bacteriano de proteínas ScFv solubles con una etiqueta E de 13 péptidos. E-tag es una secuencia derivada del gen c-myc humano y no tiene ningún efecto sobre la estructura y actividad del gen ScFv. Se puede utilizar como marcador de la proteína ScFv soluble y se pueden utilizar anticuerpos anti-etiqueta E para detectar la expresión de genes ScFv y purificar sus productos. Se transformó Escherichia coli HB2151 con el vector fago recombinante que contenía el gen ScFv y se obtuvo el producto de expresión soluble después de la inducción con IPTG. La transferencia Western con anticuerpo anti-E-tag confirmó que el producto de expresión era una proteína de fusión ScFv-E-tag. El análisis de citometría de flujo mostró que la proteína de fusión ScFv podría unirse a las células de cáncer de hígado, y la tasa positiva de células marcadas con fluorescencia fue del 30,9%, pero no se unió a las células de hígado normales ni a las células de cáncer gástrico, lo que indica que la proteína ScFv tiene cáncer de hígado. -especificidad vinculante.

Referencia

1 Gu, Chen Miaolan, Lu Rushan, etc. Visión general y perspectivas de la investigación del cáncer de hígado. Beijing: Peking Union Medical College y Beijing Medical University United Press, 1993: 1-3.

2 Hoston JS, Levinson D, Mudgett HM, et al. Ingeniería de proteínas de sitios de unión de anticuerpos: recuperación de la actividad específica en análogos de Fv monocatenarios antidigoxigenina producidos en Proc Natl Acad Sci USA. , 1988;85: 5879-5883

3 Crosson BJ, Willenberg GJ, Baker A, et al. El papel de la apoptosis en la toxicidad de células T mediada por anticuerpos biespecíficos. Br J Cancer, 1996;73(6):721-727

4, Yang, et al.

Preparación de anticuerpos monoclonales contra el cáncer de hígado humano y localización inmunohistoquímica de los antígenos correspondientes. Comunicaciones de anticuerpos monoclonales, 1989; 5(2): 33-36

5 Yang Angang, Ji Changhua, Han Hua et al. Clonación y secuenciación del gen de la región variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal anti-CD8 humano. Avances en Bioquímica y Biofísica, 1992;19(4):286-288

6 Men SC, Jenny BK, Bednarik EJ. Anticuerpo humanizado anti-Lewis Y: propiedades in vitro y farmacocinética en monos rhesus. Cancer Res, 1996;56: 1118-1125

7 Mats O, Henrik O, Michael M, et al. La combinación de cadenas ligeras de anticuerpos de alta afinidad provoca una deriva en el reconocimiento de epítopos. Molecular Immunology, 1996; 33(1): 47-56

(Manuscrito aceptado el 3 de marzo de 1998 y revisado el 26 de marzo de 1998)