Los métodos para separar mezclas de proteínas se basan principalmente en las propiedades de las proteínas en solución.
Las soluciones acuosas de sal diluida y sistemas tampón son los disolventes más utilizados para la extracción de proteínas porque tienen buena estabilidad y alta solubilidad para las proteínas. La dosis habitual es 65.438 0-5 veces el volumen de materias primas. Es necesario agitar uniformemente durante la extracción para facilitar la disolución de la proteína. La temperatura de extracción depende de la naturaleza del ingrediente activo. Por un lado, la solubilidad de la mayoría de las proteínas aumenta con la temperatura, por lo que la temperatura alta favorece la disolución y acorta el tiempo de extracción. Por otro lado, a medida que aumenta la temperatura, la proteína se irá desnaturalizando e inactivando. Por lo tanto, en base a esto, la extracción de proteínas y enzimas generalmente se realiza a bajas temperaturas (inferiores a 5°C). Para evitar la degradación durante la extracción de proteínas, se pueden agregar inhibidores de proteasa (como el fluorofosfato de diisopropilo y el ácido yodoacético).
Lo siguiente se centra en la selección del valor de pH y la concentración de sal de la solución de extracción.
1. Valor de pH
Las proteínas y enzimas son electrolitos anfóteros y tienen puntos isoeléctricos. El valor de pH de la solución de extracción debe seleccionarse en ambos lados del punto isoeléctrico.
Alcance. Al extraer con ácido diluido o álcali diluido, es necesario evitar que los grupos disociables de la proteína cambien debido a un exceso de acidez o un exceso de base, lo que da como resultado cambios irreversibles en la conformación de la proteína. Generalmente, las proteínas básicas se extraen con extractos ligeramente ácidos y las proteínas ácidas se extraen con extractos ligeramente alcalinos.
2. Concentración de sal
La dilución y la concentración pueden favorecer la disolución de las proteínas, lo que se denomina disolución de la sal. Al mismo tiempo, debido a que los iones de sal están unidos a proteínas, las soluciones salinas diluidas tienen la ventaja de proteger a las proteínas de la desnaturalización. Por lo tanto, se agrega una pequeña cantidad de sal neutra como NaCl a la solución de extracción, la concentración es generalmente de 0,1,5 mol L y el tampón suele ser fosfato y carbonato de 0,02 a 0,05 M.
(2) Método de extracción con disolventes orgánicos
Algunas proteínas y enzimas que están firmemente unidas a lípidos o contienen más cadenas laterales no polares en sus moléculas son insolubles en agua, soluciones salinas diluidas. , Ácido o base diluida. Se pueden utilizar disolventes orgánicos como etanol, acetona y butanol. Tienen cierta hidrofilicidad y fuerte lipofilicidad, lo que las convierte en soluciones de extracción ideales para lipoproteínas. Sin embargo, deben funcionar a bajas temperaturas. El método de extracción con butanol es particularmente beneficioso para extraer algunas proteínas y enzimas que están estrechamente unidas a los lípidos. En primer lugar, el butanol es muy lipófilo, especialmente en cuanto a su solubilidad. En segundo lugar, el butanol es hidrófilo y no provocará desnaturalización ni inactivación de la enzima dentro del rango de solubilidad (grado 6,6 entre 10 y 40°C). Además, el método de extracción con butanol tiene un amplio rango de pH y temperatura y también es adecuado para materiales animales, vegetales y microbianos.
2. Separación y purificación de proteínas
Existen muchos métodos para la separación y purificación de proteínas, entre los que se incluyen principalmente:
(1) Métodos de separación basados en diferentes solubilidades de proteínas. .
1. Salación de proteínas
La sal neutra tiene un impacto significativo en la solubilidad de las proteínas. Generalmente, en condiciones de baja concentración de sal, a medida que aumenta la concentración de sal, aumenta la solubilidad de la proteína, lo que se denomina solubilidad de la sal. Cuando la concentración de sal continúa aumentando, la solubilidad de la proteína disminuye en diversos grados y precipita una tras otra. Este fenómeno se llama salazón. Cuando se agrega una gran cantidad de sal a la solución de proteína, los iones de sal de alta concentración (como SO4 y NH4 del sulfato de amonio) tienen una fuerte fuerza de hidratación, que puede agarrar la capa de hidratación de las moléculas de proteína y "deshidratarlas". así las micelas de proteínas Condensación y precipitación. Al salar, el pH de la solución funciona mejor en el punto isoeléctrico de la proteína. Debido a varias partículas moleculares de proteínas,
Los factores que afectan la salinidad son: (1) Temperatura: las proteínas son relativamente sensibles a la temperatura y generalmente pueden funcionar a temperatura ambiente. En términos generales, la solubilidad de las proteínas disminuye a bajas temperaturas, pero algunas proteínas (como la hemoglobina, la mioglobina y la albúmina) tienen solubilidades inferiores a 0 grados a temperaturas más altas (25 grados). Es más fácil de salar. (2) Valor de pH: la mayoría de las proteínas tienen la solubilidad más baja en soluciones salinas concentradas en su punto isoeléctrico. (3) Concentración de proteínas: cuando la concentración de proteínas es alta, la proteína que se va a separar a menudo precipita junto con otros sitios de proteínas (* * * fenómeno de precipitación). Por lo tanto, antes de salar, el suero debe diluirse con una cantidad igual de solución salina fisiológica para que el contenido de proteínas alcance 2,5-3,0.
Las sales neutras comúnmente utilizadas en la salazón de proteínas incluyen principalmente sulfato de amonio, sulfato de magnesio, sulfato de sodio, cloruro de sodio y fosfato de sodio.
El sulfato de amonio más utilizado tiene las ventajas de un bajo coeficiente de temperatura y una alta solubilidad (la solución saturada a 25 °C es 4,1 M, o 767 g/L; la solubilidad saturada a 0 °C es 3,9 M). , o 676 g/L). Dentro de este rango de solubilidad, muchas proteínas y enzimas pueden salarse. Además, el efecto de eliminación progresiva de sal del sulfato de amonio es mejor que el de otras sales y es menos probable que provoque la desnaturalización de las proteínas. El valor de pH de la solución de sulfato de amonio suele estar entre 4,5 y 5,5. Cuando se sala con otros valores de pH, es necesario ajustarlo con ácido sulfúrico o agua con amoníaco.
Después de separar la proteína mediante salazón y precipitación, es necesario eliminar la sal de la proteína. El método habitual es la diálisis, que consiste en poner la solución de proteínas en una bolsa para su análisis (normalmente de celofán), dializarla con un tampón y sustituirlo constantemente. Debido a que la diálisis lleva mucho tiempo, es mejor realizarla a bajas temperaturas. Además, se puede utilizar para eliminar sales pasando gel de glucosa G-25 o G-50 a través de la columna, lo que lleva poco tiempo.
2. Método de precipitación isoeléctrica
Cuando la proteína está en estado electrostático, la repulsión electrostática entre partículas es mínima, por lo que la solubilidad es mínima. Varias proteínas tienen diferentes puntos isoeléctricos. La precipitación se puede lograr ajustando el valor del pH de la solución para alcanzar el punto isoeléctrico de una proteína, pero este método rara vez se usa solo y puede usarse en combinación con el método de sal.
3. Método de precipitación con disolventes orgánicos a baja temperatura
El uso de disolventes orgánicos miscibles en agua, como metanol, etanol o acetona, puede reducir la solubilidad de la mayoría de las proteínas y precipitarlas. La resolución de este método es mayor que la del método de salazón, pero la proteína se desnaturaliza fácilmente y debe realizarse a baja temperatura.
(2) Diferentes métodos de separación según el tamaño de las moléculas de proteínas.
1. Diálisis y ultrafiltración
La diálisis utiliza una membrana semipermeable para separar proteínas de diferentes tamaños moleculares.
La ultrafiltración utiliza alta presión o fuerza centrífuga para forzar el agua y otras pequeñas moléculas de soluto a través de una membrana semipermeable, mientras las proteínas permanecen en la membrana. Se pueden seleccionar membranas filtrantes con diferentes tamaños de poro para retener proteínas de diferentes pesos moleculares.
2. Filtración en gel
También conocida como cromatografía de exclusión molecular o cromatografía de tamiz molecular, es uno de los métodos más eficaces para separar mezclas de proteínas en función del tamaño molecular. Los materiales de relleno más utilizados en las columnas son gel de glucosa (Sephadex
Ged) y gel de agarosa.
(3) Separar según las propiedades cargadas de las proteínas.
Las proteínas tienen diferentes propiedades eléctricas y cargas en diferentes entornos de pH, por lo que pueden separarse.
1. Electroforesis
En las mismas condiciones de pH, varias proteínas tienen diferente movilidad en el campo eléctrico debido a diferentes pesos moleculares y cargas, por lo que pueden separarse. Cabe destacar la electroforesis por enfoque isoeléctrico, que utiliza un anfolito como portador. Durante la electroforesis, el anfolito forma un gradiente de pH que aumenta gradualmente desde el electrodo positivo al electrodo negativo. Cuando una proteína con una determinada carga nada en él, la posición del pH en su punto isoeléctrico se detiene. Este método se puede utilizar para analizar y preparar una variedad de proteínas.
2. Cromatografía de intercambio iónico
Los intercambiadores iónicos incluyen intercambiadores catiónicos (como carboximetilcelulosa; CM-celulosa) e intercambiadores aniónicos (dietilaminoetilcelulosa; DEAE? font
LANG = " ZH-CN " gt; celulosa), cuando la solución de proteína separada fluye a través de cromatografía de intercambio iónico. Cuando se utiliza una columna, se adsorben proteínas con cargas opuestas al intercambiador de iones. en el intercambiador de iones, y luego las proteínas adsorbidas se eluyen cambiando el pH o la fuerza iónica (consulte el capítulo sobre tecnología de cromatografía para obtener más detalles).
(4) Cromatografía de afinidad, un método de separación basado en la especificidad del ligando.
Cromatografía de afinidad
Cromatografía) es un método muy eficaz para separar proteínas. Aislar una proteína que se va a purificar a partir de una mezcla muy compleja de proteínas normalmente requiere solo un paso. Y la pureza es muy alta.
Este método se basa en el hecho de que ciertas proteínas pueden unirse específicamente a otra molécula llamada ligando, en lugar de a una proteína. El principio básico es que las proteínas existen en los tejidos o células como mezclas complejas, y cada tipo de célula contiene miles de proteínas diferentes, por lo que las proteínas se separan y purifican.
La caracterización es una parte importante de la bioquímica. Hasta el momento, no existe un método único o fácilmente disponible para extraer una proteína de una mezcla compleja de proteínas, por lo que a menudo se utiliza una combinación de varios métodos.
División celular
1. Trituración de tejidos a alta velocidad: convierta el material en una pasta fina, colóquelo en un cilindro con un volumen de aproximadamente 1/3 y cierre la tapa del cilindro. Con fuerza, primero ajuste el regulador de velocidad a la posición más lenta, luego encienda el interruptor y acelere gradualmente hasta la velocidad requerida. Este método es adecuado para despojos de animales, semillas carnosas de plantas, etc.
2. Homogeneizar con un homogeneizador de vidrio: primero poner el tejido cortado en el tubo de ensayo, luego introducirlo en la varilla de molienda y triturarlo hacia adelante y hacia atrás, moviéndolo hacia arriba y hacia abajo para triturar las células. Este método tiene un mayor grado de alteración celular que un triturador de tejidos de alta velocidad y es adecuado para pequeñas cantidades de órganos y tejidos animales.
3. Método de tratamiento ultrasónico: Trate la suspensión celular con ondas ultrasónicas de cierta potencia para hacer que las células vibren violentamente y se rompan. Este método funciona mejor con materiales microbianos. Escherichia coli prepara varias enzimas, eligiendo a menudo una concentración de 50-100 mg de bacterias/ml y una frecuencia de 1 kg a 10 kg.
4. Método de congelación y descongelación repetida: congelar las células por debajo de -20 °C y descongelar a temperatura ambiente, repetido varias veces. Debido a la formación de partículas de hielo en las células y al aumento de la concentración de sal en el líquido celular residual, estas se hinchan y destruyen la estructura celular.
5. Quimioterapia: Algunas células animales, como las células tumorales, pueden ser destruidas por membranas celulares como el dodecilsulfato de sodio (SDS) y el desoxicolato de sodio. Las paredes celulares bacterianas son más gruesas y se puede utilizar lisozima. mejor tratamiento.
No importa qué método se utilice para romper tejidos y células, las proteínas intracelulares o las hidrolasas de ácido nucleico se liberarán en la solución, lo que provocará la biodegradación de macromoléculas y la reducción de productos naturales. La adición de fluorofosfato de diisopropilo (DFP) puede inhibir o ralentizar la autólisis. La adición de ácido yodoacético puede inhibir la actividad de las enzimas proteolíticas que requieren grupos hidrofóbicos en el centro activo. La adición de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) también puede eliminar la actividad de los chips proteolíticos, pero no todos. Al elegir el pH, la temperatura y la fuerza iónica, estas condiciones deberían ser adecuadas para la extracción de las sustancias objetivo.
Concentración, secado y conservación
1. Concentración de la muestra
Durante el proceso de preparación de macromoléculas biológicas, la muestra se vuelve muy diluida debido a la purificación y conservación de la columna. La identificación a menudo requiere concentración. Los métodos de concentración habituales son:
1. Reducción de presión, calentamiento, evaporación y concentración.
Reducir el punto de ebullición del líquido reduciendo la presión superficial. Cuanto mayor es el grado de descompresión al vacío, menor es el punto de ebullición del líquido y más rápido se evapora. Este método es adecuado para la concentración de determinadas macromoléculas biológicas térmicamente inestables.
2. Concentración de evaporación del flujo de aire
El flujo de aire puede acelerar la evaporación del líquido, haciendo que se extienda en una fina capa de solución, con la superficie pasando constantemente por el aire. flujo o macromoléculas biológicas La solución se coloca en una bolsa de diálisis y se coloca en una habitación fría. Utilice un ventilador eléctrico para soplar la solución para que el disolvente fuera de la membrana permeable no se evapore, logrando así el propósito de concentración. Este método tiene una velocidad de concentración lenta y no es adecuado para concentrar una gran cantidad de solución.
3. Método de coagulación
Las macromoléculas biológicas forman hielo a bajas temperaturas, y las sales y macromoléculas biológicas permanecen en la fase líquida y no entran en el hielo. Durante la operación, la solución a concentrar se enfría hasta formar un sólido y luego se funde lentamente. La diferencia en los puntos de fusión entre el disolvente y el soluto se utiliza para eliminar la mayor parte del disolvente. Por ejemplo, cuando se concentra una solución salina de proteína y enzima usando este método, cristales de hielo puro sin proteína ni enzima flotan en la superficie del líquido, mientras que la proteína y la enzima se concentran en la solución inferior y los cubitos de hielo superiores se retiran. para que se puedan obtener proteínas y enzimas.
4. Método de absorción
Las moléculas de la solución son eliminadas directamente por el absorbente, concentrándolas. El absorbente utilizado no debe reaccionar químicamente con la solución, no adsorber macromoléculas biológicas y separarse fácilmente de la solución. Los adsorbentes comúnmente utilizados incluyen polietilenglicol, polivinilpirrolidona, sacarosa y gelatina.
Cuando utilice un absorbente de polietilenglicol, primero debe colocar la solución de macromolécula biológica en una bolsa de membrana semipermeable y luego cubrirla con polietilenglicol a 4 grados Celsius. El polietilenglicol absorberá rápidamente el disolvente de la bolsa. Cuando el polietilenglicol esté saturado con agua, se debe reemplazar por uno nuevo.
5. Método de ultrafiltración
La ultrafiltración es un método que utiliza una membrana especial para filtrar selectivamente varias moléculas de soluto en una solución. Cuando ningún líquido pasa a través de la membrana bajo una determinada presión (presión de nitrógeno o presión de bomba de vacío), los disolventes y las moléculas pequeñas penetran, y las moléculas grandes quedan bloqueadas y atrapadas. Este es un nuevo método desarrollado en los últimos años. Es más adecuado para la concentración o desalinización de macromoléculas biológicas, especialmente proteínas y enzimas. Tiene las ventajas de bajo costo, fácil operación, condiciones suaves, etc., y puede mantener mejor. concentración de macromoléculas biológicas activas. Alta tasa de recuperación. La clave para la aplicación de la ultrafiltración reside en la selección de membranas. Los diferentes tipos y especificaciones de membranas tienen diferentes parámetros, como el caudal de agua y el valor de corte del peso molecular (es decir, el peso molecular mínimo de las moléculas que la membrana puede interceptar en circunstancias normales), que deben seleccionarse de acuerdo con las necesidades del trabajar. Además, la forma del dispositivo de ultrafiltración, la composición y propiedades del soluto, la concentración de la solución, etc. Todos tienen un cierto impacto en el efecto de ultrafiltración. Diablo
Valor de corte de peso molecular de la membrana de ultrafiltración:
Nombre de la membrana Valor de corte de peso molecular Tamaño de poro promedio grande
XM-30030000140
XM-200100, 00055
XM-5050, 00030
PM-30 30, 00022
UM-2020, 00018
PM -1010, 00015
UM-21, 00012
UM05500 10
Los tubos de fibra hueca están hechos de las membranas de ultrafiltración mencionadas anteriormente, y muchos de estos tubos reúnen en racimos. Ambos extremos del tubo están conectados con una solución tampón de baja fuerza iónica para que la solución tampón pueda fluir continuamente en el tubo. Luego se sumerge el tubo de fibra en la solución de proteínas que se va a dializar. Cuando una solución tampón fluye a través de un tubo de fibra, las moléculas pequeñas se difunden fácilmente a través de la membrana, mientras que las moléculas más grandes no. Este es el método de análisis de filtración de fibra. Debido al aumento del área de diálisis, el tiempo de diálisis se reduce en 65.438 00.
En segundo lugar, el secado
Para evitar el deterioro y facilitar el almacenamiento, los productos preparados a partir de macromoléculas biológicas suelen requerir secado. Los métodos más utilizados son la liofilización y el secado al vacío. El secado al vacío es adecuado para secar y conservar sustancias que no son resistentes a las altas temperaturas y se oxidan fácilmente. Todo el dispositivo incluye un secador, un condensador y un principio de secado al vacío, al tiempo que aumenta el coeficiente de temperatura. Bajo la misma presión, la presión del vapor de agua disminuye a medida que disminuye la temperatura, por lo que a bajas temperaturas y bajas presiones, el hielo puede sublimar fácilmente hasta convertirse en gas. En funcionamiento, el líquido que se va a secar generalmente se congela por debajo del punto de congelación para volverlo sólido, y luego el solvente se convierte en gas a baja temperatura y baja presión para su eliminación. El producto seco es suelto, tiene buena solubilidad, tiene una estructura natural y es adecuado para secar y conservar diversas macromoléculas biológicas.
En tercer lugar, el almacenamiento
La estabilidad de las macromoléculas biológicas está estrechamente relacionada con el método de almacenamiento. El producto seco es generalmente relativamente estable y su actividad no cambiará significativamente a bajas temperaturas durante varios días o incluso años. Los requisitos de almacenamiento son muy simples, siempre que la muestra seca se selle en un desecador (lleno de desecante) y se almacene en un refrigerador a 0-4 grados. Al almacenar en forma líquida, se deben tener en cuenta los siguientes puntos.
1. La muestra no puede estar demasiado diluida y debe concentrarse hasta una determinada concentración antes de poder envasarse y almacenarse. Las muestras demasiado diluidas pueden desnaturalizar fácilmente las macromoléculas biológicas.
2. Generalmente es necesario añadir conservantes y estabilizantes. Los conservantes de uso común incluyen tolueno, ácido benzoico, cloroformo, timol, etc. Las proteínas y enzimas suelen estabilizarse con pasta de sulfato de amonio, sacarosa, glicerol, etc. Por ejemplo, a las enzimas también se les pueden agregar sustratos y coenzimas para aumentar su estabilidad. Además, soluciones como el calcio, el zinc y el ácido bórico también tienen cierto efecto protector sobre determinadas enzimas. Las macromoléculas de ácido nucleico suelen almacenarse en tampones estándar en cloruro de sodio o citrato de sodio.
3. La temperatura de conservación es baja, la mayoría se conservan en el frigorífico a unos 0 grados, y algunas son más bajas, dependiendo de las distintas sustancias.