Aplicaciones de las células madre embrionarias animales
Las ventajas de utilizar células madre embrionarias para producir animales clonados en los últimos años. Las células embrionarias tempranas de animales, los grupos de células en embriones animales, las células ES animales y las células germinales primordiales animales son todas totipotentes y pluripotentes. Las células embrionarias tempranas de los animales tienen el menor número y son fáciles de diferenciar in vitro. Las células germinales primordiales animales tienen características similares a las células ES y pueden inducirse a diferenciarse in vitro para formar una variedad de tejidos. Sin embargo, el número limitado de PGC limita su aplicación. Las células ES animales son totipotentes y pluripotentes y pueden proliferar y congelarse in vitro, lo que las convierte en un material ideal para la clonación de animales.
1.2 La importancia del uso de células madre embrionarias para producir animales clonados
1.2.1 Puede mejorar enormemente la eficiencia reproductiva del ganado mejorado: células ES y quimeras embrionarias, transferencia nuclear ES y otras tecnologías pueden lograr que la mejora de los animales domésticos sólo produzca animales genéticamente más homogéneos en un corto período de tiempo. Esto no sólo aprovechará al máximo el potencial de producción de los animales mejorados, sino que también acelerará el proceso de mejora de los animales.
1.2.2 Salvar animales en peligro de extinción y preservar recursos genéticos animales raros: utilizando la tecnología de clonación de células es, por un lado, los animales en peligro de extinción se pueden reproducir en grandes cantidades en poco tiempo y la población de animales en peligro de extinción puede rápidamente expandidas; por otro lado, las células totipotentes congeladas podrían servir como donantes para trasplantes nucleares para clonar animales raros.
1.2.3 Creación de nuevas especies: Mediante la transferencia nuclear y el quimerismo embrionario de animales xenogénicos, se pueden obtener animales clonados o quimeras de animales xenogénicos con nuevos rasgos, que pueden superar los obstáculos a la reproducción entre especies, crear nuevas especies. y adquirir nuevos rasgos que no se pueden obtener mediante métodos de apareamiento tradicionales.
1.2.4 proporciona nuevos materiales para la biología experimental: utilizando la tecnología de transferencia nuclear, se pueden clonar al mismo tiempo individuos biológicos con exactamente la misma base genética. Estos organismos se pueden utilizar para la estimación de parámetros genéticos, la evaluación del valor nutricional de los piensos y la investigación sobre la relación entre el medio ambiente y los animales.
Producción de animales transgénicos
2.1 Procedimientos y métodos para producir animales transgénicos El método de utilización de células es para producir animales transgénicos es el siguiente:
(1) Método de inclusión de embriones: se inyecta una cierta cantidad de células ES transgénicas en blastocistos o se cultivan conjuntamente con embriones desnudos para producir embriones quiméricos transgénicos. Los embriones quiméricos transgénicos se trasplantan a las ovejas receptoras en celo para dejarlas preñadas y producir embriones quiméricos que contienen exógenos. genes.animales compuestos;
(2) Método de transferencia nuclear: utilice células ES transgénicas como donantes para el trasplante nuclear para producir embriones transgénicos y trasplantar los embriones transgénicos a hembras receptoras para producir animales transgénicos.
2.2 La importancia de producir animales transgénicos En comparación con los métodos de reproducción tradicionales, las ventajas de utilizar células ES para producir animales transgénicos son:
(1) Romper los límites de las especies y abrirse paso la relación La restricción de las relaciones acelera la variación genética de las poblaciones animales.
(2) Se pueden llevar a cabo mutaciones direccionales y reproducción. Se utiliza tecnología de recombinación homóloga para manipular genéticamente las células ES y se producen animales transgénicos mediante trasplantes nucleares. Es posible crear nuevas especies;
(3) Utilizando la tecnología de células madre embrionarias, los embriones se pueden seleccionar tempranamente a nivel celular. Esto mejora la precisión de la selección y acorta el tiempo de reproducción.
El uso de células negativas para producir animales transgénicos juega un papel importante en los siguientes aspectos:
2.2.1 Promover el crecimiento animal y aumentar la producción de productos pecuarios: Ratas, ganado vacuno, ovejas y El gen GH humano se introdujo sucesivamente en el genoma del ratón, y los ratones transgénicos obtenidos durante el período de crecimiento rápido (5 a 11 semanas) crecieron cuatro veces más rápido que el grupo de control. Los resultados de la investigación con cerdos transgénicos con bGH muestran que el aumento de peso diario de los cerdos transgénicos aumenta y la tasa de conversión alimenticia mejora considerablemente.
2.2.2 Producción de proteínas medicinales: Las proteínas utilizadas en el extranjero se pueden obtener a partir del plasma y la leche de animales genéticamente modificados. La ventaja de extraer plasma de óvulos recombinante de animales transgénicos es que la sangre se puede recolectar repetidamente sin matar a los animales. La desventaja es que la cantidad de sangre recolectada es limitada y algunas proteínas recombinantes biológicamente activas se secretan en el plasma, lo que tiene un cierto impacto. sobre salud animal. Las glándulas mamarias de los animales tienen una gran capacidad para absorber, sintetizar y secretar proteínas, y pueden procesar proteínas recombinantes (incluidas β-hidroxilación, glicosilación, γ-hidroxilación, etc.) y pueden plegar proteínas recombinantes en conformaciones funcionales. Por tanto, la glándula mamaria de los animales transgénicos se convierte en un órgano ideal para la producción de proteínas recombinantes.
2.2.3 Mejora de la resistencia a enfermedades animales: Clonando ciertos segmentos codificantes de un genoma de virus específico, modificándolos y transfiriéndolos al genoma de animales domésticos.
Si el transgén puede expresarse en el genoma del huésped, el ganado debería tener cierta resistencia a la infección viral. Yamashita et al. insertaron las cadenas sentido y antisentido del gen Mx de ratón clonado en un vector de retrovirus aviar y lo transfectaron en fibroblastos embrionarios de pollo (CEF). Los resultados mostraron que el vector retroviral transfectado con la cadena sensorial (CEF) era resistente a la infección por el virus de la influenza humana y el virus de la influenza aviar.
Producción de órganos animales para trasplante de órganos humanos
3.1 Unir células ES humanas con embriones de cerdos y otros animales para proporcionar órganos trasplantables para humanos a través de animales quiméricos humano-cerdo. De esta forma se puede superar el rechazo inmunológico provocado por el trasplante de diferentes órganos animales.
3.2 Inducir directamente la diferenciación de células madre embrionarias humanas para formar órganos humanos para trasplante. Los embriones humanos clonados se producen fuera del cuerpo mediante transferencia nuclear de células somáticas. Cuando el embrión clonado se convierte en un embrión quístico, el ICM embrionario humano se aísla y se cultiva in vitro para obtener células ES. Luego, las células ES se inducen a diferenciarse in vitro para producir tejidos celulares, incluidos músculos, nervios y células hematopoyéticas humanas [5]. Se ha informado que se indujo a las células ES a producir células hematopoyéticas, células nerviosas y tejido cardíaco in vitro y se trasplantaron a ratones adultos. Los embriones de fertilización in vitro y los embriones de transferencia nuclear de células somáticas proporcionan materiales experimentales para el aislamiento y la clonación de células madre embrionarias humanas. El éxito de la clonación de células madre embrionarias humanas a partir de células germinales primordiales ha abierto una nueva forma de utilizar esta tecnología para producir dispositivos humanos. Pittenger et al. han aislado células pluripotentes humanas a partir de células mesenquimales humanas. Estos han promovido el progreso de la investigación en el uso de células madre embrionarias humanas para crear órganos humanos.
3.3 Introducir genes humanos en células es de animales como los cerdos para producir cerdos con genes aviares-humanos y utilizar cerdos transgénicos para proporcionar materiales de trasplante para órganos humanos.
Una forma de estudiar la expresión y regulación genética en células eucariotas es introducir genes exógenos en células es para estudiar el papel de los genes en la diferenciación celular y el desarrollo embrionario. Otro método consiste en utilizar tecnología de integración y posicionamiento de genes para mutar, eliminar o perder la función de genes en sitios específicos de las células es para estudiar la diferenciación y el desarrollo embrionario de células biológicas que carecen de genes específicos, determinando así el papel de genes específicos en el desarrollo biológico. El papel del proceso se refleja específicamente en:
4.1 Utilizar tecnología transgénica para estudiar la relación entre las funciones endocrinas de los animales. Por ejemplo, mediante el uso de tecnología de mapeo genético para destruir genes relacionados con células embrionarias, se pueden preparar modelos de ratón con disfunción tiroidea, suprarrenal, ovárica y pancreática para estudiar la relación entre la hipertensión y la función reproductiva y la regulación de la secreción de hormonas hipotalámica-hipofisaria. . Los ratones que portan el promotor de metalotioneína y el gen de la hormona de crecimiento humana o de rata son mucho más grandes que los ratones normales debido a la sobreexpresión del gen de la hormona de crecimiento humana o de rata.
4.2 La tecnología de mapeo genético se puede utilizar para estudiar el proceso de formación de tumores, y se pueden utilizar ratones transgénicos para estudiar el proceso de formación de tumores. La especificidad de la tumorigénesis en ratones consanguíneos sugiere que la tumorigénesis es genética. La formación de tumores en ratones transgénicos proporciona material para una mayor comprensión del proceso desde la proliferación celular hasta la formación de tumores.
4.3 Usar tecnología de mapeo genético para estudiar la relación entre las hormonas y los genes que controlan el desarrollo biológico, usar tecnología de manipulación genética celular para agregar o eliminar genes que controlan el desarrollo biológico, preparar ratones con genes eliminados o determinados genéticamente, y Observe el rendimiento de dichos ratones y su respuesta a los efectos hormonales relevantes. La tecnología de manipulación genética de células ES proporciona una herramienta para estudiar sistemáticamente los mecanismos reguladores de hormonas y genes en el crecimiento y desarrollo animal desde el nivel celular hasta el individual.
4.4 Encontrar una nueva tecnología que combine la captura de genes relacionados con el crecimiento y el desarrollo con células ES, que puedan identificar cualquier gen expresado durante el desarrollo animal y sus actividades. Por ejemplo, se sabe que la estructura de una proteína desempeña un papel importante en el desarrollo biológico. Su ADNc correspondiente se puede sintetizar mediante tecnología RT-PCR y la ubicación del gen en el cromosoma se puede determinar mediante tecnología de hibridación molecular. Utilizando tecnología de manipulación genética de células madre embrionarias, podemos explorar intencionadamente los patrones de expresión espaciotemporal de los genes de la familia homeobox y su relación con la diferenciación celular y el desarrollo embrionario.
5. Establecer un modelo animal para estudiar enfermedades genéticas humanas. Piedrahita et al. utilizaron PJPB y PNMC109 (que contienen secuencias del gen G418 resistente a la neomicina y del gen aPloE) y utilizaron tecnología de recombinación mesenquimal para localizar y manipular. es células del gen de la apolipoproteína E, preparan células ES deficientes en el gen aPLOE y las introducen en la cavidad del blastocisto para formar embriones quiméricos. Se cruzan ratones mutantes machos y hembras para producir ratones con mutaciones en el gen ApLoE [13].
Este ratón mutante que porta el gen APDE proporciona un modelo animal para que los científicos estudien la deficiencia de apolipoproteína y su tratamiento clínico.
6. Estudiar el papel de las células ES en el desarrollo embrionario. Hirofumi et al. introdujeron el gen de la β-galactosidasa en las células ES y luego quimerizaron las células ES transfectadas con el gen β-gal con embriones tempranos. Al detectar la expresión del gen β-gal, estudiamos el papel de las células ES en la diferenciación celular, el desarrollo embrionario y la participación en la formación de diversos tejidos.
Estudiar la expresión genética y las funciones fisiológicas de sus productos. La tecnología de manipulación de genes de células madre embrionarias también se puede utilizar para estudiar las funciones fisiológicas de proteínas o enzimas. Cozzi et al. utilizaron tecnología de recombinación homóloga para destruir el gen que codifica el inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP) en células ES, lo que resultó en la eliminación de genes de metaloproteinasas en células ES. Sus características son similares a las de las células homogéneas y son más invasivas que las células ES ordinarias.
8. Estudiar la relación entre la longitud de la secuencia de recombinación homóloga y la eficacia global del gen extraño. Heinte et al. insertaron el fragmento del gen Rb con genes marcadores neo, hyg y HPRT en el sitio Bgl del vector y transfectaron células es. La tasa de integración de genes extraños llega al 78% [16]. Cuando se utiliza tecnología de recombinación homóloga para posicionar y manipular el genoma, la secuencia de recombinación homóloga no puede ser demasiado pequeña, de lo contrario se reducirá la precisión de la operación. Thomas et al. diseñaron un vector de manera que la secuencia mutada se ubicara a miles de bases de ambos lados del sitio del gen diana de recombinación homóloga. Utilizando este vector de secuencia de ADN alternativo, se realizó una manipulación genética refinada del locus Hprt en células ES de ratón para generar líneas celulares mutantes HPRT. Si la longitud del ADN de la secuencia de recombinación homóloga es inferior a 1 kd, se reducirá la precisión de la recombinación. Utilizando vectores de inserción y vectores de reemplazo como herramientas, Hasty et al. demostraron que la eficacia de la mutación dirigida al sitio está relacionada con la longitud de la secuencia del gen homólogo del vector. Cuando la secuencia homóloga aumenta gradualmente entre 1,3 y 6,7 KB, la eficacia. de mutación dirigida al sitio también aumenta. Si la secuencia de bases de recombinación homóloga es mayor que la longitud crítica (6 ~ 8 kb), la eficacia de la mutagénesis dirigida al sitio disminuirá.
Para estudiar el mecanismo de diferenciación celular, mediante el uso de tecnología de cultivo de células ES in vitro, se pueden estudiar sistemáticamente y sin interferencias factores individuales que afectan la diferenciación de células embrionarias. Las funciones principales de las células ES en la investigación de la diferenciación celular son:
9.65438+ Si las personas pueden usar las células ES para comprender el mecanismo de diferenciación celular, pueden manipular las células desde los niveles de transcripción y traducción de genes, y direccionalmente. cambiar la dirección de la diferenciación celular.
9.2 Investigación sobre la diferenciación direccional de células ES Las células ES cultivadas se someterán a una diferenciación direccional para formar ciertos tipos de células tisulares después de la eliminación de factores inhibidores de la diferenciación o la adición de factores inductores. La investigación de Thomas encontró que las células ES cultivadas in vitro pueden diferenciarse en saco vitelino visceral, islas de sangre y cardiomiocitos. Los experimentos de Smith et al. demostraron que las células embrionarias pueden diferenciarse en mesodermo en un medio sin inhibidores de diferenciación; cuando las células ES están en un medio que contiene guanina y ácido retinoico, se diferencian en endodermo de la pared corporal.