Tecnología de vanguardia|Introducción a la tecnología de secuenciación unicelular

Introducción La tecnología de secuenciación unicelular es la tecnología de vanguardia en el campo de las ciencias de la vida en el siglo XXI. Desde su nacimiento, ha aportado muchos nuevos descubrimientos para el desarrollo de la ciencia y ha sido nombrada "Tecnología del año" por importantes revistas como Nature durante varios años consecutivos. Como técnico en el campo de las células individuales,

1. ¿Por qué es tan popular la tecnología de secuenciación de células individuales?

? Las células son la base para el funcionamiento de los organismos y los procesos biológicos, y varían ampliamente en tipo, comportamiento y estado (es decir, heterogeneidad celular). El método tradicional de secuenciación de genes (Bulk RNA-seq) detecta tejidos y el resultado es el promedio de todas las células, ignorando las diferencias entre las células. Por ejemplo, algunas células tienen niveles de transcripción más altos y otras tienen niveles de transcripción más bajos. Al mismo tiempo, si la proporción de celdas objetivo es pequeña, la información de estas celdas se promediará o sobrescribirá.

? La tecnología de secuenciación unicelular resuelve el problema de la secuenciación de ARN por lotes, que puede capturar ácidos nucleicos (ADN o ARN) en una sola célula y crear una base de datos para obtener información en una sola célula. El análisis de células individuales (scRNA-seq) puede reflejar la heterogeneidad de las células dentro de una población y las funciones importantes de pequeños grupos de células, especialmente las diferencias sutiles entre las células. Por lo tanto, la tecnología de secuenciación unicelular también se denomina "microscopía molecular".

? La tecnología de secuenciación unicelular apareció por primera vez en 2009, y el profesor Tang Fuchou de la Universidad de Pekín propuso y publicó el primer artículo sobre unicelular. Se ha estado desarrollando continuamente durante más de diez años, especialmente en los últimos años, la secuenciación unicelular ha experimentado un desarrollo y una popularidad explosivos. En 2011, la revista Nature Methods catalogó los métodos de investigación unicelular como una de las áreas tecnológicas más destacadas de los próximos años. En 2013, la revista "Science" incluyó la secuenciación unicelular como los seis campos más destacados del año, y la revista "Nature Methods" incluyó la aplicación de la secuenciación unicelular como el desarrollo metodológico más importante de 2013. El 16 de octubre de 2017, se anunció oficialmente el primer lote de 38 proyectos financiados por el Proyecto Atlas de Células Humanas, que es comparable al Proyecto Genoma Humano, marcando el comienzo de una nueva era de secuenciación unicelular.

2. ¿El principio de la tecnología de secuenciación unicelular

? Actualmente, existen dos formas de implementar la secuenciación unicelular. Una es obtener directamente células individuales a través de medios microscópicos y obtener los materiales de ácido nucleico que contienen para la construcción de la biblioteca. La tecnología representativa es smart-seq2, que utiliza el método de flujo para separar y obtener células individuales. Sin embargo, las células individuales se separan una por una y el rendimiento de la secuenciación separada es muy bajo, principalmente limitado por el costo. A medida que aumenta el número de células individuales que se van a analizar, el coste de la secuenciación aumenta casi linealmente.

? Otra forma es introducir tecnología de etiquetado molecular, que agrega una secuencia de ADN única a cada célula mientras aísla células individuales. De esta manera, cuando se analizan después de la secuenciación, se considerará que las secuencias que llevan el mismo código de barras provienen de la misma célula. Al crear una base de datos a la vez, se puede medir información sobre cientos de celdas individuales. Además, el contenido de las especies de ARNm varía en un amplio rango y la amplificación puede introducir un sesgo adicional, lo que dificulta el recuento preciso del número de copias de ARNm. Por lo tanto, se introdujo la secuencia aleatoria del Identificador Molecular Único (UMI) para marcar diferentes moléculas de ARNm con una firma única antes de la amplificación, lo que permite distinguir las moléculas originales de las secuencias repetitivas amplificadas.

? En la actualidad, los pasos de la secuenciación unicelular están básicamente unificados. Los experimentos de ScRNA-seq implican principalmente los siguientes pasos modulares: preparación de suspensión de células individuales, aislamiento y lisis de células individuales, extracción de ARNm, transcripción inversa (RT) de ARNm en ADNc, construcción de bibliotecas de secuenciación y análisis de datos utilizando herramientas computacionales.

? Con el desarrollo de la tecnología unicelular, la aplicación de scRNA-seq se ha expandido desde la investigación básica a la investigación clínica, como la construcción de perfiles de expresión genética biológica, la reconstrucción de linajes de desarrollo celular, el descubrimiento de biomarcadores de enfermedades, el análisis de microambientes inmunes tumorales y el diagnóstico clínico, etc. .

3. ¿Retos técnicos de la tecnología de secuenciación unicelular

? 1) Aislar de forma precisa y rápida células individuales; 2) Amplificar trazas de ARN de células individuales; 3) Mejorar el rendimiento celular para el procesamiento paralelo a gran escala y reducir el presupuesto para la preparación y secuenciación de bibliotecas individuales.

4) El método scRNA-seq se limita al análisis de ARNm poliadenilado y no analiza especies de ARN poliadenilado, incluido el ARN no codificante y las modificaciones de ARN. El método scRNA-seq actual aún no se ha explorado. 5) Los métodos experimentales y computacionales carecen de control de calidad y puntos de referencia estandarizados. 6) La resolución del transcriptoma espacial aún no ha alcanzado el verdadero nivel unicelular.

Cuatro. Referencia

1. Tang Fuchou, Barbacholu, Wang, et al. Análisis de transcriptoma completo de mRNA-seq de células individuales. Método natural. 6(5): 377-82(2009)

2. Tang, x, Huang, y, Lei, j. Nuevos avances en la tecnología de secuenciación unicelular y sus aplicaciones en medicina. Cell Biosci 9, 53 (2019)

3. Tecnología de secuenciación de ARN unicelular de Drosophila y sus aplicaciones. Biología del desarrollo interdisciplinaria de Wiley. 2021

4. Chen Yong, Song Jun, Yang Chun, etc. Tecnologías de secuenciación unicelular: desde transcriptomas hasta mediciones multidimensionales. Pequeños caminos. 2021