Métodos para determinar si las células están vivas o muertas
Métodos para identificar células vivas y muertas:
La identificación de células vivas y muertas es de gran importancia en biología y medicina. Durante el proceso de cultivo celular, el crecimiento de las células debe registrarse en cualquier momento y la tasa de supervivencia de las células debe medirse con frecuencia en el estudio de las células tumorales para probar la letalidad de varios fármacos en las células tumorales. También es necesario medir la tasa de supervivencia de las células tumorales. La identificación de células vivas y muertas también tiene grandes aplicaciones en la medicina clínica. Por ejemplo, para detectar la fertilidad de un hombre, medir la viabilidad de los espermatozoides es un método común.
Existen muchos métodos para identificar células vivas y muertas, siendo habitual la tinción y el análisis instrumental. La tinción es un método comúnmente utilizado para identificar células vivas y muertas, que es simple y fácil de operar. Sin embargo, a través de la observación morfológica directa para identificar si las células están vivas o muertas, los resultados experimentales se ven fácilmente afectados por los factores subjetivos del operador y existen ciertos errores, por lo que en las operaciones reales, a menudo se utilizan algunos instrumentos para una detección precisa de lotes.
Los diferentes métodos para identificar células vivas y muertas tienen diferentes mecanismos de reacción específicos, pero no importa qué método se utilice, todos aprovechan las diferencias en las funciones y propiedades fisiológicas de las células vivas y muertas.
Los métodos más utilizados incluyen la tinción y el análisis instrumental:
1 Tinción
Los métodos de tinción se dividen en tinción química y tinción fluorescente según el mecanismo de tinción. , los tintes tiñen las células muertas o las células vivas. Las diferencias en funciones y propiedades fisiológicas entre células vivas y muertas incluyen principalmente:
La diferencia en la permeabilidad de la membrana celular entre células vivas y muertas: la membrana celular de las células vivas es una membrana selectiva que desempeña una función protectora y de barrera. importante para las células y sólo permite el paso de sustancias de forma selectiva. Después de la muerte celular, la membrana celular se daña y aumenta la permeabilidad; El método comúnmente utilizado para identificar células vivas y muertas utilizando azul tripán aprovecha esta propiedad. Azul tripán. También conocido como azul tripán, es un tinte aniónico que no puede penetrar las membranas celulares intactas. Por lo tanto, solo se teñirán las células muertas después de la tinción con azul tripán, mientras que las células vivas no se teñirán. El azul de metilo tiene un mecanismo de tinción similar. La plasmólisis de células vegetales también puede identificar la vida y la muerte.
La diferencia en el metabolismo entre células vivas y muertas: es la base para utilizar el tinte azul de metileno para identificar células de levadura vivas y muertas. El azul de metileno es un tinte no tóxico, la forma oxidada es azul y la forma reducida es incolora. Debido al metabolismo en las células vivas, las células tienen una fuerte capacidad reductora, que puede cambiar el azul de metileno de una oxidación azul a una forma reductora incolora. Por lo tanto, después de la tinción con azul de metileno, las células vivas de levadura son células incoloras o células viejas con un metabolismo lento; debido a su capacidad no reductora o a su capacidad reductora extremadamente débil, mantienen el azul de metileno en estado de oxidación, tiñéndose así de azul o azul claro.
El diacetato de fluoresceína (FDA) es un colorante comúnmente utilizado para determinar la viabilidad de cultivos de células animales y vegetales y de protoplastos de células vegetales. Su mecanismo de tinción también aprovecha la diferencia en el metabolismo entre las células vivas y muertas: el FDA en sí no produce fluorescencia y no es polar, y puede penetrar libremente dentro y fuera de las membranas celulares intactas. Cuando el FDA ingresa a las células vivas, se descompone. por lipasa intracelular para generar fluoresceína polar es una sustancia que no es tóxica y puede producir fluorescencia. Esta sustancia no puede penetrar libremente la membrana celular viva y se acumula en la membrana celular, lo que hace que las células viables produzcan fluorescencia verde mientras que las células no viables. No puede descomponer la FDA y no puede producir fluorescencia.
Además, existen algunos colorantes patentados para orgánulos. Como el rojo neutro, un tinte patentado del sistema vacuolar. El rojo neutro es un tinte poco tóxico que puede enrojecer las vacuolas de las células vivas, pero el citoplasma y el núcleo no se tiñen o las vacuolas de las células muertas no se tiñen o se tiñen ligeramente, y el tinte se difunde por toda la célula; El núcleo y el citoplasma se tiñen de rojo. A veces se pueden usar dos tintes en combinación para aumentar el efecto de teñido, como el teñido mixto azul de metilo y rojo neutro.
2 Métodos de análisis instrumental
Se pueden utilizar tecnología de microelectrodos (que utilizan la diferencia de potencial en ambos lados de la membrana celular viva y muerta), contadores de células de análisis completamente automáticos y citómetros de flujo para analizar Detección por lotes precisa de muerte y supervivencia celular.
El analizador de células/contador de células/analizador de células Cedex totalmente automático producido por INNOVATIS en Alemania es el primer analizador de células de escaneo (patentado) de alta resolución y alta definición del mundo con una plataforma totalmente automática de tinción con azul Pan. , imágenes microscópicas CCD y software de estación de trabajo CEDEX se pueden utilizar para el recuento y análisis de células en investigación y desarrollo y procesos de producción industrial en productos farmacéuticos, medicina, fermentación, inmunidad, patología, pruebas de toxicidad, biotecnología y otras disciplinas.
Resultados del análisis automático, salida de datos de detección y análisis (11 elementos): número total de células, concentración total de células (células/mL, número de células vivas, concentración de células vivas (células/mL), concentración de células muertas (células/); ml)); tasa de supervivencia celular (%); redondez promedio de las células (compacidad); proporción de grupos de células (um); mapa de distribución del diámetro de las células (histograma de diámetro); Histograma); gráfico de distribución de circularidad celular (Histograma de compacidad); Curva de tiempo de crecimiento celular (Gráfico de tiempo de cultivo).
Hay dos categorías principales de sondas fluorescentes de uso común que se utilizan para determinar si las células están vivas o muertas mediante citometría de flujo: una es una sustancia que puede ingresar a la célula a través de la membrana celular viva y emitir fluorescencia, por ejemplo. , La FDA puede ser detectada por células vivas. Permanece y emite fluorescencia de color amarillo verdoso. Si las células se dañan, se perderá y no se observará fluorescencia. El otro tipo no puede penetrar las membranas de las células vivas, pero puede teñir los núcleos de las células fijas y de las células con membranas dañadas. Por ejemplo, se utilizan habitualmente yoduro de propidio (PI, yoduro de propidio) y bromuro de etidio (EB, bromuro de etidio). sonda fluorescente. El yoduro de propidio (PI) no puede penetrar la membrana celular y no puede teñir células normales o células apoptóticas con membranas celulares intactas. En el caso de las células necróticas, se pierde la integridad de la membrana celular y el yoduro de propidio (PI) puede teñir las células necróticas. Un kit de detección de apoptosis y necrosis de uso común contiene dos tintes fluorescentes, Hoechst 33342 y yoduro de propidio (yoduro de propidio, PI). Cuando las células sufren apoptosis, la cromatina se condensará. Hoechst 33342 puede penetrar la membrana celular. Después de la tinción, la fluorescencia de las células apoptóticas mejorará significativamente que la de las células normales. Después de la doble tinción con los dos tintes anteriores, cuando se detectan mediante citometría de flujo o microscopía de fluorescencia, las células normales muestran una fluorescencia roja débil + una fluorescencia azul débil, las células apoptóticas muestran una fluorescencia roja débil + una fluorescencia azul fuerte y las células necróticas muestran una fluorescencia roja fuerte +. Fuerte fluorescencia azul.