¿Cuáles son las preguntas frecuentes sobre el cultivo celular primario?
Causas de problemas comunes en el cultivo celular primario y sus soluciones:
El valor del pH del medio de cultivo cambia demasiado rápido
Posibles razones
(1) La tensión de CO2 es incorrecta
(2) La tapa del frasco de cultivo está demasiado apretada
(3) La fuerza amortiguadora del sistema tampón NaHCO3 es insuficiente
(4) La concentración de sal en el medio de cultivo es incorrecta
(5) Contaminación por bacterias, levaduras o hongos
Soluciones sugeridas
(1) Aumentar la concentración de NaHCO3 en el medio de cultivo o reducir la concentración de CO2 en la incubadora. La concentración de NaHCO3 de 2,0 g/L a 3,7 g/L corresponde a una concentración de CO2 del 5% al 10%.
(2) Afloje la tapa de la botella 1/4 de vuelta.
(3) Cambiar a medio de cultivo independiente de CO2. Agregue tampón HEPES a una concentración final de 10 a 25 mM.
(4) Utilice un medio de cultivo preparado a base de sal de Earle en un entorno de cultivo de CO2, y utilice un medio de cultivo preparado a base de sal de Hanks en un entorno de cultivo atmosférico.
(5) Desechar el cultivo o utilizar antibióticos para esterilizarlo.
La solución de cultivo precipita, pero el valor del pH permanece sin cambios
Posibles razones
(1) Después de la limpieza con detergente, queda fosfato, lo que precipita los componentes del medio de cultivo. Bajar
(2) Congelar el medio de cultivo
Soluciones sugeridas
(1) Enjuagar la cristalería repetidamente con agua desionizada y luego esterilizarla.
(2) Calentar el medio de cultivo a 37°C y agitar para disolverlo. Si aún existe el precipitado, desechar el medio de cultivo.
La solución de cultivo precipita y el pH cambia al mismo tiempo
Posibles motivos
Contaminación bacteriana o fúngica
Soluciones sugeridas
Deseche el cultivo o esterilice con antibióticos.
Las células cultivadas no se adhieren a la pared
Posibles razones
(1) Digestión excesiva con tripsina
(2) Contaminación por micoplasma< /p >
(3) El fondo de la botella de cultivo no está limpio
(4) El valor de pH de la solución de cultivo es demasiado alcalino (NaHCO3 se descompone)
( 5) La solución de digestión o la solución de cultivo están preparadas incorrectamente, almacenamiento caducado, almacenamiento inadecuado
Envejecimiento celular
Soluciones sugeridas
(1) Acortar el tiempo de digestión de tripsina o reducir la concentración de tripsina.
(2) Aislar el cultivo y detectar micoplasma. Limpiar el soporte y la incubadora. Si se encuentra contaminación por micoplasma, deseche el cultivo.
(3) Preste atención al cepillado o reemplácelo con botellas de cultivo de plástico desechables.
(4) Utilice una solución de ácido acético estéril para ajustar el valor del pH o llénelo con CO2 estéril (exponga el solución de cultivo para También puedes ponerla en la incubadora por vía oral)
(5) Reconfigurar el líquido digestivo o el líquido de cultivo
El crecimiento de las células cultivadas se ralentiza
Posibles razones
(1) Debido al cambio de diferente medio de cultivo o suero
(2) Algunos componentes esenciales para el crecimiento celular, como la glutamina o los factores de crecimiento en el medio de cultivo, se agotan o faltantes o han sido destruidos.
(3) Hay una pequeña cantidad de contaminación bacteriana o fúngica en el cultivo
(4) Almacenamiento inadecuado de los reactivos
(5) La concentración inicial de células inoculadas es demasiado baja
Soluciones sugeridas
(1) Compare los componentes del nuevo medio de cultivo y el medio de cultivo original, y compare el suero nuevo y el suero antiguo para respaldar experimentos de crecimiento celular. Deje que las células se adapten gradualmente al nuevo medio de cultivo.
(2) Reemplace con medio de cultivo recién preparado o agregue glutamina y factores de crecimiento.
(3) Utilice medio de cultivo libre de antibióticos para el cultivo. Si se encuentra contaminación, deseche el cultivo. O utilizar antibióticos para eliminar las bacterias.
(4) El suero debe almacenarse entre -5 ℃ y -20 ℃. El medio de cultivo debe almacenarse en la oscuridad a 2-8°C. El medio de cultivo completo que contiene suero debe almacenarse a 2-8°C y usarse dentro de 2 semanas.
(5) Aumentar la concentración inicial de células inoculadas
Las células cultivadas mueren
Posibles motivos
(1) No hay CO2 en la incubadora
(2) La temperatura en la incubadora fluctúa demasiado
(3) Las células se dañan durante la criopreservación o recuperación.
(4) La presión osmótica del medio de cultivo no es alta. Correcto
(5) Acumulación de metabolitos tóxicos en el fluido de cultivo
Soluciones sugeridas
(1) Detección de CO2. en la incubadora
(2) Comprobar la temperatura en la incubadora
(3) Tomar nuevas especies de células preservadas
(4) Pruebe la presión osmótica de la medio de cultivo. Nota: la mayoría de las células de los mamíferos pueden tolerar una presión osmótica de 260 a 350 mOsm/kg. Agregar reactivos adicionales como HEPES o medicamentos puede afectar la presión osmótica del medio de cultivo.
(5) Reemplazar con medio de cultivo fresco