Rutas técnicas y puntos claves para la preparación de anticuerpos monoclonales
1. Los ratones BALB/C de raza pura con selección animal son dóciles, tienen una pequeña variedad de actividades, están lejos del nido, son débiles, tienen poca ingesta y excreción de alimentos y, en general, pueden hacerlo. mantenerse en un laboratorio limpio. Sobrevivir. Actualmente, la mayoría de los laboratorios que desarrollan tecnología de hibridoma utilizan ratones BALA/C de pura raza.
2. Protocolo de inmunización La elección de un protocolo de inmunización adecuado es crucial para el éxito de la hibridación por fusión celular y la adquisición de anticuerpos monoclonales de alta calidad. Generalmente, según el plan de inmunización establecido, la primera inmunización se inicia unos dos meses antes de la fusión, la cual debe determinarse en función de las características del antígeno.
(1) Los antígenos solubles tienen una inmunogenicidad débil y generalmente requieren adyuvantes. Antes de preparar adyuvantes, se deben preparar haptenos con inmunógenos. Adyuvantes de uso común: adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund.
Antígeno de inmunización inicial 1 ~ 50 μg más inyección subcutánea o intraperitoneal adyuvante completa de Freund (generalmente 0,8 ~ 1 ml, 0,2 ml/punto).
↓Después de 3 semanas
La segunda dosis de inmunización es la misma que la anterior, con el adyuvante incompleto de Freund añadido por vía subcutánea o ip (inyección intraperitoneal) (la dosis ip no debe exceder los 0,5 ml) .
↓A las 3 semanas
La tercera dosis de inmunización es la misma, sin adyuvante, IP (se extraerá sangre a los 5 a 7 días para determinar el título)
↓ 2 ~ 3 semanas
Para mejorar la inmunidad, la dosis adecuada es 50 ~ 500 μg, ip o iv (inyección intravenosa).
↓Después de 3 días
Fusión del bazo
En la actualidad, la pauta de inmunización contra antígenos solubles (especialmente algunos antígenos débiles) se actualiza constantemente, como por ejemplo: ① Antígenos solubles Convertirlo en partículas o inmovilizarlo puede mejorar la inmunogenicidad del antígeno y, por otro lado, reducir la dosis del antígeno. ② Cambie el método de inyección del antígeno. La inmunidad básica se puede inyectar directamente en el bazo. ③ El uso de citoquinas como adyuvantes puede mejorar el nivel de respuesta inmune del cuerpo y mejorar la reactividad de las células inmunes a los antígenos.
(2) Los antígenos de partículas tienen una fuerte inmunidad y pueden lograr buenos efectos inmunológicos sin necesidad de adyuvantes. Tomando como ejemplo los antígenos celulares, la cantidad de antígeno necesaria para la inmunidad es de 1 a 2 × 107 células.
La primera inmunización es 1×107/0,5ml ip
↓ 2 a 3 semanas después
La segunda inmunización es 1×107/0,5ml ip.
↓Después de 3 semanas
Aumentar la inmunidad (tres días antes de la fusión) 1×107/0,5 ml ip o iv
↓
Fusión de bazo
Fusión celular
Preparación antes de la fusión celular.
(1) Selección de líneas celulares de mieloma: Las células de mieloma deben pertenecer a la misma cepa que los animales inmunizados, para que la tasa de hibridación y fusión sea alta, además es conveniente inocular hibridomas para producir una gran número de monoclones en la cavidad abdominal de ratones de la misma cepa. Las líneas celulares de mieloma utilizadas habitualmente se muestran en la tabla 2-4.
Tabla 2-4 Principales líneas celulares de mieloma utilizadas en experimentos de fusión
Nombres nominales
Laiyuan
Sustancias resistentes a los medicamentos
Cadena Ig
Nivel superior
P3/X63-Ag8
BALB/Mieloma C MOPC-21
8- azaguanina
r1 K
P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)
P3/X63-Ag8
8-azaguanina
- -
P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)
P3 /X63-Ag8
8-azaguanina
-k (no secretada)
P3/X63-Ag8. Hibridoma Ul(P3Ul)
(X63×BALB/C)
8-azaguanina
- -
SP2/0 -Ag14(SP2/0)
(X63×BALB/C células del bazo) hibridoma
8-azaguanina
- -
Factor comparativo de sensibilidad a oligomicina
Mieloma BALB/C
8-azaguanina
- -
S194/5.
XXO.BU.1
P3/X63-Ag8
5-bromodeoxiuridina
- -
MPC 11-45,6 TG 1,7
Mieloma BALB/C MPC-11
6-mercaptoguanina
r2b K
210.RCY3.Ag1 .2.3
Mieloma de piojo R210
8-azaguanina
- K
GM15006TG-A12
Mieloma humano GM1500
6-Mercaptoguanina
r1 K
Uranio-266AR
Mieloma Humano U-266
8-Azaguanina
ε λ
Las células de mieloma se pueden cultivar en medios ordinarios, como RPMI1640 y DMEM. La concentración de suero de ternera es generalmente del 10% al 20%, la concentración de células es de 104 ~ 5×105/ml y la concentración máxima no debe exceder los 106/ml. Cuando las células se encuentran en la fase media de crecimiento logarítmico, se pueden pasar en una proporción de 1:3 ~ 1:10. Pasaje cada 3 a 5 días. Durante el proceso de paso celular, algunas células pueden tener atavismo y deben tratarse con 8-azaguanina regularmente para que las células supervivientes sean uniformemente sensibles a HAT.
(2) Células alimentadoras: en el cultivo de tejidos, es difícil cultivar y reproducir células individuales o unas pocas células dispersas. Si se añaden otras células vivas, se puede promover el crecimiento y la reproducción de estas células. El número de estas células agregadas se denomina células alimentadoras. En el proceso de preparación de anticuerpos monoclonales, muchos pasos requieren la adición de células alimentadoras, como el cribado, la clonación y el cultivo de expansión de células de hibridoma. Las células alimentadoras comúnmente utilizadas son: macrófagos peritoneales de ratón (más comúnmente utilizados), esplenocitos o timocitos de ratón. Algunas personas también utilizan la línea celular de fibroblastos de ratón 3T3 irradiados con radiación como células alimentadoras. El número de células alimentadoras es generalmente de 2 x 104 o 105 células/pocillo.
2. Pasos de la fusión celular
(1) Preparación de la capa de células alimentadoras: Generalmente se utilizan macrófagos peritoneales de ratón.
Los ratones BALB/C de la misma cepa que los ratones inmunizados se utilizan habitualmente durante 6 a 10 semanas.
↓
Tira el cuello hasta matarlo y sumérgelo en alcohol al 75% durante 3 a 5 minutos.
↓
Utilice tijeras esterilizadas para hacer una incisión en la piel y exponer el peritoneo.
↓
Utilice una jeringa esterilizada para inyectar 5 ~ 6 ml de medio de cultivo preenfriado (está estrictamente prohibido perforar los intestinos).
↓
Enjuague repetidamente y succione el líquido de enjuague.
↓
Poner el líquido de lavado en un tubo de centrífuga de 10ml y separar a 1200rpm/ durante 5 a 6 minutos.
↓
Suspender con 20% de suero bovino (NCS) o suero fetal bovino (FCS) y ajustar el número de células a 1×105/ml.
↓
Añadir 100 μl/pocillo a la placa de 96 pocillos.
↓
Pone 37. Cultivo en incubadora de dióxido de carbono
(2) Preparación de células inmunes del bazo
Tres días después de la última inmunización de refuerzo, mate al ratón tirando de su cuello.
↓
Retirar asépticamente el bazo y enjuagarlo una vez con medio de cultivo.
↓
Triturar el bazo y tamizar por un colador de acero inoxidable.
↓
Centrifugar y lavar las células dos veces con medio de cultivo.
↓
Recuento
↓
Tomar 108 suspensión de linfocitos del bazo para su uso posterior.
(3) Preparación de células de mieloma
Centrifugar células de mieloma de crecimiento logarítmico.
↓
Lavar dos veces con medio de cultivo libre de suero.
↓
Cuenta ×107 celdas para su uso posterior.
(4) Integración
① Mezcle células de mieloma y esplenocitos en una proporción de 1:10 o 1:5 y utilice medio de cultivo incompleto sin suero en un tubo de centrífuga de 50 ml. Lavar una vez y centrifugar a 1200 rpm durante 8 minutos desechar el sobrenadante y utilizar una pipeta para absorber el líquido residual para evitar afectar la concentración de polietilenglicol (PEG).
Golpee suavemente el fondo del tubo de centrífuga para aflojar ligeramente el sedimento celular.
②Agregue 1 ml de solución de PEG al 45 % (peso molecular 4000) precalentada a 37 °C en ②90 s y agite suavemente mientras agrega. Baño María a 37 ℃ durante 90 s
③Agregue 37. c Precaliente el medio incompleto para terminar el efecto PEG y agregue 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml y 6 ml cada 2 minutos.
④Centrifugar a 800 rpm durante 6 minutos.
⑤ Rellenar con sobrenadante y resuspender en medio selectivo HAT que contenga un 20% de suero de ternera.
⑥ Agregue las celdas anteriores a la placa de 96 pocillos existente con la capa de células alimentadoras y agregue 100 μl a cada pocillo. Generalmente, un bazo inmune puede inocular cuatro placas de 96 pocillos.
⑦ Colocar la placa de cultivo en una incubadora a 37°C y 5% CO2.
Selección de células de hibridoma y detección de anticuerpos
1. Seleccionar células de hibridoma, células de bazo y células de mieloma, y tratarlas con PEG para formar una mezcla de varias células, solo células de bazo. Son significativas las células de hibridoma formadas con células de la médula ósea. Cuando las células de mieloma se cultivan en medio selectivo HAT, no pueden crecer ni reproducirse debido a la falta de timidina quinasa o hipoxantina guanina ribosiltransferasa, mientras que las células de hibridoma pueden crecer y reproducirse en medio selectivo HAT.
En 1 o 2 días del cultivo selectivo de HAT, una gran cantidad de células tumorales murieron. Después de 3 a 4 días, las células tumorales desaparecieron y las células híbridas formaron pequeñas colonias. Después del cultivo selectivo HAT durante 7 a 10 días, se debe utilizar medio HT y luego medio de cultivo normal durante 2 semanas. Durante el proceso de cultivo selectivo anterior, cuando las células de hibridoma cubren 1/10 del área en el fondo del pocillo, se pueden detectar anticuerpos específicos y se puede seleccionar la línea celular de hibridoma deseada. Durante el cultivo selectivo, normalmente se reemplaza la mitad del medio de cultivo cada 2 o 3 días.
2. Detección de anticuerpos Los métodos de detección de anticuerpos deben elegir diferentes métodos de detección según la naturaleza del antígeno y el tipo de anticuerpo. Generalmente, el principio es utilizar un método rápido, simple, específico y sensible.
Los métodos comúnmente utilizados son: (1) RIA se puede utilizar para detectar antígenos solubles y anticuerpos monoclonales celulares. (2) Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) McAb se utiliza para detectar antígenos, células y virus solubles. (3) La prueba de inmunofluorescencia es adecuada para detectar anticuerpos monoclonales contra antígenos de la superficie celular. (4) Otros como prueba de hemaglutinación indirecta, prueba de citotoxicidad, prueba de adsorción de doble capa de adhesión rotacional, etc.
Clones de hibridoma
Los clones de hibridoma generalmente se refieren a clones de pocillos positivos para anticuerpos. Porque los clones de hibridoma analizados por HAT no pueden garantizar que solo haya un clon en un pozo. En el trabajo real, puede haber varios o incluso más clones, que pueden incluir células secretoras de anticuerpos, células no secretoras de anticuerpos, células secretoras de anticuerpos deseados (anticuerpos específicos) y otras células secretoras de anticuerpos no relacionadas. Se necesita clonación para separar estas células entre sí. El principio de la clonación es clonar clones híbridos positivos para anticuerpos lo más rápido posible; de lo contrario, las células secretoras de anticuerpos inhibirán las células secretoras de anticuerpos, porque las células secretoras de anticuerpos crecen más rápido que las células secretoras de anticuerpos y la competencia. entre los dos conducirá a la pérdida de células secretoras de anticuerpos. Incluso las células de hibridoma clonadas deben volver a clonarse periódicamente para evitar que muten o pierdan cromosomas, perdiendo así la capacidad de producir anticuerpos.
Existen muchos métodos de clonación, los más utilizados son el método de dilución limitante y el método de placa de agar blando.
1. Clonación por dilución limitante
(1) La capa de células alimentadoras (fusión de sincitio) se prepara 1 día antes de la clonación.
2) Secar las células de hibridoma a clonar de los pocillos de cultivo y contarlas.
(3) Ajuste las células a 3 ~ 10 células/ml.
(4) Tome la placa de cultivo de células alimentadoras preparada el día anterior y agregue 100 μl de células diluidas a cada pocillo. Cultivo en incubadora a 37°C y 5% de CO2.
(5) Cambie el medio al séptimo día y luego cada 2 a 3 días.
(6) La formación de clones celulares se puede observar en 8 a 9 días y la actividad de los anticuerpos se puede detectar a tiempo.
(7) Transfiera las células con pocillos positivos a una placa de 24 pocillos para cultivo expandido.
(8) Cada clon debe congelarse lo antes posible.
2. Clon de cultivo en agar blando
(1) Preparación de agar blando: RPMI1640, el doble de concentración de NCS (suero de ternera) al 20%.
①Solución acuosa de agar al 1%: autoclave, precalentado a 42°C.
②Agar 0,5%: preparado a partir de 1 parte de agar 1% y suero de ternera 20% con 2 veces la concentración de rpmi 1640. Mantener la temperatura a 42°C.
(2) Vierta 15 ml de la solución de agar al 0,5 % anterior (que contiene células alimentadoras) en una placa de Petri de 9 cm de diámetro, solidifique a temperatura ambiente y sirva como capa base.
(3) Preparar la suspensión celular a clonar a una concentración de 100/ml, 500/ml o 5000/ml.
(4) Mezclar 1 ml de solución de agar al 0,5% (precalentada a 42°C) y 1 ml de suspensión celular a temperatura ambiente.
(5) Después de mezclar, verterlo inmediatamente sobre la matriz de agar, solidificar a temperatura ambiente durante 65,438±00min e incubar en una incubadora a 37°C y 5% de CO2.
(6) Después de 4 a 5 días, se verán colonias blancas del tamaño de la punta de una aguja. Después de 7 a 10 días, las semillas se transferirán directamente a 24 pocillos que contienen células alimentadoras para cultivo.
(7) Detección de anticuerpos, amplificación de cultivos y reclonación necesaria.
Crioconservación y recuperación de células de hibridoma
1. Criopreservación de células de hibridoma Es muy importante congelar las células subclonas obtenidas de cada clon de células de hibridoma en el pocillo original de manera oportuna. . importante. Porque cuando no se establece una línea celular que secrete anticuerpos de manera estable, la contaminación celular y la pérdida de la capacidad de secreción de anticuerpos pueden ocurrir en cualquier momento durante el proceso de cultivo celular. Sin la criopreservación de las células originales, todos los esfuerzos anteriores pueden resultar en vano debido a los accidentes antes mencionados.
Las células de hibridoma se congelan del mismo modo que otras líneas celulares. En principio, cada ampolla debe contener más de 1 x 106 células. Sin embargo, debido a los diferentes entornos de cultivo, las células de hibridoma de los pocillos originales se pueden congelar en una placa de cultivo de 24 pocillos. Cuando el fondo de cada hoyo esté lleno, se puede colocar una ampolla en cada hoyo.
Solución de criopreservación celular: 50% suero de ternera; 40% medio incompleto; 10% DMSO (dimetilsulfóxido).
Lo mejor es preenfriar el refrigerante y operarlo suave y rápidamente. Al congelarlo, se puede enfriar inmediatamente desde temperatura ambiente a 0 °C, luego colocarlo en un refrigerador de temperatura ultrabaja a -70 °C y transferirlo a nitrógeno líquido al día siguiente. También se pueden utilizar dispositivos de criopreservación celular para la criopreservación. Las células criopreservadas deben reactivarse periódicamente y comprobarse la viabilidad celular y la estabilidad de los anticuerpos secretados. Las células pueden almacenarse en nitrógeno líquido durante varios años o más.
2. Método de recuperación celular: retire con cuidado la ampolla de vidrio del nitrógeno líquido, colóquela en un baño de agua a 37 °C, descongele las células congeladas en 65438 ± 0 minutos, lave las células dos veces con cultivo completo. medio y luego moverlo al matraz de cultivo de células alimentadoras preparado el día anterior y colocarlo en una incubadora a 37°C y 5% de CO2 para el cultivo. Cuando las células forman colonias, se mide la actividad de los anticuerpos.
Producción en masa de anticuerpos monoclonales
Existen dos métodos principales para la producción en masa de anticuerpos monoclonales:
(1) Cultivo in vitro mediante tubos de cultivo rotativos. Un gran Se recogieron varias células de hibridoma y se obtuvieron anticuerpos monoclonales de los sobrenadantes. Sin embargo, el rendimiento de este método es bajo y el contenido de anticuerpos en el medio de cultivo es generalmente de 10 ~ 60 μg/ml. Si se produce en grandes cantidades, el coste será elevado.
(2) Inocular células de hibridoma in vivo y preparar ascitis o suero.
①Método de tumor sólido: se inoculan células de hibridoma en la fase de crecimiento logarítmico en la parte inferior de la espalda de ratones en una proporción de 1 ~ 3×107/ml, y se inyectan 0,2 ml en cada sitio, * * * 2 ~ 4 puntos. La sangre se puede recolectar después de que el tumor alcance un cierto tamaño (generalmente de 10 a 20 días) y el contenido de anticuerpos monoclonales obtenido del suero puede alcanzar de 1 a 10 mg/ml. Pero la cantidad de sangre extraída es limitada.
②Preparación de ascitis: El método convencional consiste en inyectar por vía intraperitoneal 0,5 ml de fitano o parafina líquida en ratones BALB/C, y luego inyectar por vía intraperitoneal 1×106 células de hibridoma 1 a 2 semanas después. La ascitis puede ocurrir de 7 a 10 días después de la inoculación de las células, y se debe observar de cerca el estado de salud del animal y los signos de ascitis. La ascitis también se puede extraer con una jeringa y recolectar varias veces. El contenido de anticuerpos monoclonales en el líquido ascítico puede alcanzar entre 5 y 10 mg/ml, que es actualmente el método más utilizado. Las células del líquido ascítico también se pueden congelar, y la ascitis se producirá en la cavidad abdominal de ratones trasplantados después de la reanimación.
Identificación de anticuerpos monoclonales
Es muy necesario identificar sistemáticamente los anticuerpos monoclonales preparados. Se deben identificar los siguientes aspectos:
Identificar la especificidad. de anticuerpos, además de utilizar inmunógenos (antígenos) para detectar anticuerpos, también se deben realizar pruebas cruzadas con otros antígenos relacionados con sus componentes antigénicos. Estos métodos pueden ser ELISA e IFA. Por ejemplo: ① Para preparar anticuerpos monoclonales contra células de melanoma, además de las células de melanoma, las células tumorales de otros órganos también deben reaccionar de forma cruzada con células normales para detectar anticuerpos monoclonales contra antígenos específicos de tumores o relacionados con tumores. ② Para preparar anticuerpos monoclonales contra citocinas recombinantes, primero considere si hay reacción cruzada con la proteína de la cepa de expresión y luego considere si hay reacción cruzada con otras citocinas.
2.Identificación de la clase Ig y subclases de 2. Cuando McAb generalmente se analiza con anticuerpos secundarios marcados con enzima o fluoresceína, básicamente se ha determinado el tipo Ig del anticuerpo. Si se utiliza IgG o IgM anti-ratón de conejo marcada con enzima o fluoresceína, el anticuerpo detectado generalmente es IgG o IgM. Para las subclases, se requiere doble amplificación o ELISA tipo sándwich usando un sistema de suero anti-subclase estándar. En la prueba de doble expansión, si se agrega una cantidad adecuada de PEG (3%), es más propicio para la formación de líneas de precipitación.
3. Identificación de la actividad neutralizante de los anticuerpos monoclonales La actividad biológica de los anticuerpos monoclonales se determina mediante experimentos de protección en animales o células. Por ejemplo, si se determina la actividad neutralizante de un anticuerpo monoclonal antiviral, el anticuerpo y el virus pueden inocularse en animales susceptibles o células sensibles al mismo tiempo para observar si los animales o las células están protegidos por los anticuerpos.
4. Identificación de los epítopos antigénicos reconocidos por los anticuerpos monoclonales Los sitios antigénicos reconocidos por los anticuerpos monoclonales se determinan mediante pruebas de unión competitiva y mediciones del índice de aditividad para determinar si los epítopos antigénicos reconocidos por los anticuerpos monoclonales son los mismos.
5. Determinación de la afinidad de los anticuerpos monoclonales La prueba de unión competitiva ELISA o RIA se utiliza para determinar la afinidad de los anticuerpos monoclonales por el antígeno correspondiente.
Referencia:/topic/163/3/34067.html