Las dificultades y soluciones en la expresión de células de mamíferos han sido resueltas para usted.
¿Los marcadores de estreptococo mencionados anteriormente? (haga clic aquí para ver) historia y ahora nos centraremos en los marcadores de estreptococos? Aplicaciones de sistemas de expresión de células de mamíferos.
Aunque el sistema de expresión de E. coli es económico, usarlo para expresar proteínas eucariotas puede afectar el plegamiento y la función de la propia proteína debido a la falta de lípidos importantes, conjugados moleculares y modificaciones postraduccionales importantes. . Tomando como ejemplo las proteínas de membrana, el sistema de expresión de E. coli puede afectar la posición de inserción de la proteína diana en la membrana celular y su función prevista [1]. Además, cuando la proteína objetivo tiene más de 50 kDa, se pueden expresar proteínas incompletas utilizando el sistema de E. coli [2].
Por lo tanto, para estudiar la función de proteínas específicas (como vías de señalización), producir proteínas más grandes o realizar análisis estructurales de alta resolución, cada vez más grupos experimentales eligen sistemas de expresión de mamíferos para la producción de proteínas de fusión. . La razón es que las proteínas recombinantes producidas por células de mamíferos son muy similares a las proteínas humanas, con plegamiento completo de proteínas, unión y modificaciones postraduccionales [3]. Por lo tanto, cada vez más científicos prestan atención a cómo purificar eficazmente las proteínas diana de las células de mamíferos.
Selección de etiquetas de afinidad
En primer lugar, debemos considerar elegir una etiqueta de afinidad adecuada. Las etiquetas de afinidad comúnmente utilizadas en los sistemas de expresión de mamíferos incluyen His-tag, FLAG-tag, GST-tag y Strep-tag. [4-12] etc. , organizados en la siguiente tabla:
Estas etiquetas de afinidad tienen sus propias ventajas en su uso.
Un problema común al utilizar His-tag es la unión no específica entre la proteína huésped y el relleno, especialmente durante la purificación de proteínas recombinantes de mamíferos. Dado que hay muchas proteínas que contienen residuos de histidina en el sistema, la estructura de esta proteína es similar a la etiqueta his y es fácil de unir a la columna de níquel, por lo que la pureza de la proteína objetivo se reduce [13].
El sistema FLAG-tag se puede purificar en condiciones no desnaturalizantes para obtener proteínas activas de alta pureza, pero su desventaja es que el medio de purificación es inestable y el coste de purificación es mucho mayor [5].
Otra etiqueta comúnmente utilizada es la etiqueta GST, una proteína de 26 kDa caracterizada por una alta expresión y una alta antigenicidad. A menudo se utiliza para aumentar la solubilidad de la proteína objetivo, pero a menudo afecta las propiedades de la proteína objetivo. Generalmente se recomienda retirar la etiqueta después de la purificación [8].
¿Qué pasa con la etiqueta de estreptococo? (¿Incluyendo Strep-tag? ¿Tipo II o Double Streptococcus tag?) es una etiqueta peptídica corta de 8 o 28 aminoácidos, que generalmente no interfiere con el plegamiento o la actividad de las proteínas, por lo que es adecuada para la investigación funcional de proteínas [5]. ¿Marcadores de estreptococos? ¿Puede unirse específicamente a los estreptococos? (Medio de segunda generación) o tacto de Streptococcus? Sitios de unión para biotina en XT (medio de tercera generación). La destiobiotina (aplicable a la segunda generación) o la biotina (tercera generación) utilizadas durante la elución tienen una mayor afinidad por el mismo sitio de unión y pueden eliminar la proteína diana de la misma posición, por lo que la pureza de la proteína diana obtenida es generalmente alta. 95%[12].
¿Tres generaciones de estreptococos al mismo tiempo? ¿XT y Strep-tag? La afinidad de la proteína mejora enormemente al agregar directamente el sobrenadante de cultivo de células de mamífero que contienen la proteína objetivo (nota: antes de afectar el rendimiento de la purificación, cubra la biotina en el medio de cultivo con avidina o BioLock), todo se puede purificar de manera efectiva. Requiere proteínas.
¿Estreptococos de tercera generación? La afinidad con XT es notable.
¿La figura a compara los marcadores de His y los marcadores de Streptococcus? La expresión de la proteína de interés se purifica agregándola directamente al sobrenadante de cultivos de células de mamíferos.
Imagen a: ¿Tácticas de estreptococos? Se agregaron simultáneamente la columna de gravedad de 1 ml de alta capacidad XT (izquierda) y la columna de gravedad Ni-NTA de 1 ml (derecha) con sobrenadante de cultivo celular ExpiCHO que contenía 4 mg de Michely-Twin-Strep-Tag (TST) o Michely-His-Tag (HIS) fluorescente. solución de proteína (Nota: Todos los siguientes experimentos se realizaron con leche materna. Como se puede ver en la figura, ¿Strep-Tactin?
Además, probamos otras proteínas como SEAP (72 kDa) o anticuerpos (mAb, refinado a 55 kDa). La Figura b muestra SEAP-TST purificada con XT, mAb. Los resultados del análisis SDS-PAGE de Henry-TST y Ma b-TST muestran que para diferentes proteínas, el sistema Strep-tag puede purificar. la proteína objetivo con alta pureza (Nota: la marca roja es el producto de degradación de mCherry, no heterocigoto).
Figura b
¿Porque la proteína objetivo? suero La Tabla C resume los datos de varios experimentos, mostrando que cuando la concentración de proteína objetivo es inferior a 20 μl/ml, el rendimiento aún puede alcanzar casi el 100 %.
Strep.HEK293 (células de riñón embrionario humano), que es más fácil de usar que CHO. Probamos el rendimiento de purificación de Streptomycin XT: la Tabla D1 muestra la concentración de proteínas objetivo después de que se usó Expi293 para expresar SEAP-TST o McHenry-. Proteínas TST La Figura D2 muestra el análisis SDS-PAGE de expresión purificada. Se puede observar que, al igual que en el medio de cultivo ExpiCHO, 1 ml de Strep-Tactin? /p>
Figura D2
En resumen, el marcador estreptocócico es muy adecuado para expresar la proteína de interés en líneas celulares de mamíferos. El proceso de purificación también es compatible con los medios comunes ExpiCHO y Expi293, lo que hace que el marcador estreptocócico sea muy adecuado para expresar la proteína de interés en líneas celulares de mamíferos. El proceso experimental es más conveniente. Además, la ventaja de pureza de este sistema es la mejor opción para esta aplicación.
Referencia
1. Proteínas eucariotas activas mediante sistemas de expresión bacterianos: una revisión de las estrategias biotecnológicas actuales. Mol Cell Biochemistry, 307(1- 2):249-64
2. McCafferty J (2004). Producción de proteínas solubles de mamíferos en E. coli: identificación de características proteicas asociadas con una expresión exitosa. BMC Biote chnol. , 4:32.doi:10.1186/1472-6750-4-32
3. Expresión génica en células de mamíferos y sus aplicaciones. Toro farmacéutico senior. , 3(2): 257-63.doi:10.5681/APB 2013.042
4. Caracterización y optimización de matrices de péptidos para estudiar las interacciones epítopo-anticuerpo mediante imágenes por resonancia de la superficie del platino. Química anal. , 74(20):5161-8.
5. Descripción general de las fusiones de proteínas etiquetadas: desde los fundamentos moleculares y bioquímicos hasta los sistemas comerciales. Microbiología aplicada. Biotecnología, 60(5): 523-33.
doi:10.1007/s 00253-002-1158-6
6. Lichty JJ, Malecki JL, Agnew HD, Michaelson-Horowitz DJ, Tan S (2005). Comparación de etiquetas de afinidad para la purificación de proteínas. Expresión y purificación de proteínas. , 41(1):98-105.
7.Tessema M, Simons PC, Cimino DF, Sánchez L, Waller A, Posner RG, Wandinger-Ness A, Prossnitz ER, Sklar LA (2006) . La proteína de fusión glutatión-S-transferasa-proteína fluorescente verde revela una disociación lenta de perlas de alta densidad de sitios y se mide el glutatión libre. Citología a., 69(5):326-34.
8.Kimple ME, Brill AL, Pasker RL (2013). Descripción general de las etiquetas de afinidad para la purificación de proteínas. Protocolos modernos para la ciencia de las proteínas. , 73:9,9 unidades. doi:10.1002/0471140864 PS 0909s 73.
9. Manual de cromatografía de afinidad, volumen 2: proteínas marcadas.
10. Termo Fisher Scientific (2015). Manual de expresión de proteínas
11. Biosensores dinámicos (2018) Nota de aplicación: ¿Captura de alta afinidad de proteínas marcadas en switchSENSE? ¿Biochips que utilizan proteínas tácticas estreptocócicas? XT.
12.IBA Lifesciences (2016) Nota de aplicación: ¿Strep-Tactin? XT: ¿Doble etiqueta de estreptococo? -Ventajas respecto a los sistemas de purificación His-tag.
13. Falk JJ Bornhorst JA (2000). Purificación de proteínas mediante etiquetas de afinidad de polihistidina. Métodos Enzimología. , 326:245-54.
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Fuente del artículo: Asociación Internacional de Abogados
Tema: ¿Proteína táctica de estreptococo? XT, etiqueta de afinidad