¿Cuál es el propósito de los medios culturales?
Según las diferentes materias primas utilizadas, se pueden dividir en dos categorías: los medios naturales preparados con ingredientes naturales como caldo y jugo de papa; los medios preparados con químicos y etiquetados con ingredientes se denominan medios sintéticos o Integrales; medio de cultivo. La mayoría de los medios de los reactivos químicos son medios sintéticos. Debido a que el medio líquido no es fácil de almacenar durante mucho tiempo, ahora se convierte en polvo. Debido a las diferentes materias primas, los requisitos de almacenamiento del medio de cultivo también son diferentes, y el almacenamiento y la conservación también son ligeramente diferentes. Generalmente, el medio de cultivo se contamina o descompone fácilmente por bacterias después de absorber calor y humedad. Debe almacenarse en un lugar fresco, a prueba de humedad y de luz. Algunos de ellos requieren una desinfección rigurosa.
Los medios habituales son:
1. Medio de cultivo bacteriano
Receta 1 medio de cultivo agar pasta de ternera
Pasta de ternera 0,3g, 1,0 g de peptona, 0,5 g de cloruro de sodio, 1,5 g de agar,
100 ml de agua
Agregue 100 ml de agua al vaso de precipitados, agregue pasta de carne, peptona y cloruro de sodio, use crayones para marcar el cubilete y calentarlo al fuego. Después de que todos los ingredientes del vaso se hayan disuelto, agregue el agar y revuelva constantemente para evitar que se pegue al fondo. Cuando el agar esté completamente disuelto, compense la pérdida de agua y ajuste el pH a 7,2 ~ 7,2 con ácido clorhídrico al 10% o hidróxido de sodio al 10%.
Patata Mediana Fórmula II
Tomar 250g de corazón de ternera fresco (sin grasa ni vasos sanguíneos), picarlo en carne picada con un cuchillo, añadir 500ml de agua destilada y 5g de peptona , ponerlo en un vaso de precipitados Márquelo, déjelo hervir y cocine a fuego lento durante 2 horas. Filtrar, secar la carne picada filtrada y ajustar el valor de pH del filtrado a aproximadamente 7,5. Añadir 10ml de caldo y una pequeña cantidad de descorazonado de ternera a cada tubo de ensayo, esterilizar y reservar.
Preparación de medio de cultivo de rizobios
Glucosa 10g, hidrogenofosfato dipotásico 0,5g
3g carbonato cálcico y 0,2g sulfato de magnesio.
Levadura en polvo 0,4g, agar 20g.
Agua 1000ml 1 solución de violeta cristal 1ml.
Primero añade agua a hervir y disuelve el agar, luego añade el resto de ingredientes, remueve para disolver, envasa y esteriliza para su uso posterior.
2.Medio de cultivo de actinomicetos
Medio agar almidón fórmula 1 (medio gaussiano)
Almidón soluble 2g, nitrato potásico 0,1g.
0,05g de hidrogenofosfato dipotásico y 0,05g de cloruro sódico.
0,05g de sulfato de magnesio y 0,001g de sulfato ferroso.
Agar 2g agua 100ml.
Primero ponga el almidón en un vaso de precipitados, use 5 ml de agua para hacer una pasta, luego vierta 95 ml de agua, revuelva uniformemente y luego agregue otros medicamentos para disolver. Marque el exterior del vaso, agregue agar cuando esté caliente a ebullición y revuelva constantemente hasta que el agar se disuelva por completo para compensar la pérdida de agua. Ajuste el valor de pH a 7,2 ~ 7,4, tome alícuotas y esterilice para su uso posterior.
Agar Harina Mediana Fórmula II
60g de harina, 20g de agar.
Agua 1000 ml
Hacer una masa con agua, añadir agua hasta 500 ml y cocinar a fuego lento durante 30 minutos. Tomar otros 500 ml de agua, agregar agar, calentar y hervir hasta disolver, mezclar los dos líquidos uniformemente, agregar agua, ajustar el pH a 7,4, tomar alícuotas, esterilizar y reservar.
3. Medio de cultivo de hongos
Receta del medio de cultivo Sabouraud
10g de peptona 20g de agar
40g de maltosa 1000ml de agua.
Primero añadir agua a la peptona y el agar, luego calentar y remover constantemente. Después de que se disuelva el agar, agregue 40 gramos de maltosa (o glucosa), revuelva para disolver, luego empaquete y esterilice para su uso posterior.
Esta cepa de cultivo se utiliza habitualmente para cultivar una variedad de hongos.
Agar Medio Patata Azúcar Fórmula II
Lavar y pelar las patatas, cortar 200 gramos en trozos pequeños, añadir 1000 ml de agua, cocinar media hora y reponer agua. Agregar 10 gramos de agar al filtrado, hervir para disolver, luego agregar 20 gramos de azúcar (sacarosa para el cultivo de moho, glucosa para el cultivo de levadura), agregar agua, tomar alícuotas, esterilizar y reservar.
Ajuste el valor de pH de este medio a 7,2 ~ 7,4, y el azúcar de la fórmula, como la glucosa, también se puede utilizar para cultivar actinomicetos y bacilos.
Medio de cultivo de zumo de brotes de soja formulado
Brotes de soja 100g agar 15g.
Glucosa 20g, agua 1000ml.
Lavar los brotes de soja, añadir agua y hervir durante 30 minutos. Filtrar con una gasa, agregar agar al filtrado, calentar para disolver, luego agregar azúcar, remover para disolver, agregar agua hasta 1000 ml, envasar y esterilizar para uso posterior.
Ajuste el valor de pH de este medio a 7,2 ~ 7,4, que puede usarse para cultivar bacterias y actinomicetos.
Receta agar cuatro guisantes mediano
Agar guisantes 80 5g
200 ml de agua
Añadir 80 guisantes secos al agua y hervir 65438 ± 0 horas, filtrar con gasa, agregar agar al filtrado, hervir hasta disolver, tomar alícuotas, esterilizar y reservar.
4. Medio de cultivo de hongos comestibles
Receta 1 Medio de cultivo patata-sacarosa-agar
20 zumo de patata 1000 ml
Sacarosa 20g , agar 18g.
Lavar y pelar las patatas y cortarlas en trozos pequeños. Pesar 200 gramos de patatas en dados, añadir 1000 ml de agua, hervir durante 20 minutos y luego filtrar. Complete el agua en el jugo filtrado hasta 1000 ml para obtener un 20% de jugo de papa hirviendo. Agregar agar y sacarosa al jugo de papa hirviendo, hervir para disolver, agregar agua, envasar y esterilizar.
Receta 2 Patata Mediana Integral
20 Zumo de Patata 1000ml
3g Dihidrogenofosfato de Potasio 1,5g Sulfato de Magnesio.
Glucosa 20g, vitamina 10 mg.
Agar 18g
Primero preparamos 20 gramos de jugo de patata hervida. El método es el mismo que el anterior. Agregue los ingredientes anteriores al jugo hervido, caliente para disolver, agregue agua y ajuste el pH a 6. Aliquot, esterilizar y reservar. Este medio de cultivo se utiliza para cultivar y conservar hongos comestibles como Ganoderma lucidum, Pleurotus ostreatus y hongos Shiitake.
5. Medio de cultivo de tabaco
En el cultivo de tejidos vegetales, el tejido calloso se puede diferenciar en raíces o brotes ajustando la proporción de IAA a CTK. Cuando CTK/IAA es alto, los callos pueden diferenciarse y brotar.
Cuando CTK/IAA es bajo, el sistema radicular se diferencia; una relación CTK/IAA moderada mantiene el callo indiferenciado.
Preparación del medio de inducción de callos
Basado en el licor madre medio MS, agregar 100mL de licor madre de macroelementos 20× y oligoelementos de licor madre 100× en un recipiente de aluminio limpio de 20mL. sal de hierro 100× licor madre 20mL, vitamina 100× licor madre 20mL, inositol 200× licor madre 10mL. Después de preparar el medio MS, agregue 0,5 mg L-1 Ba8ml y 0,5 mg L-1 NAA8mL, luego agregue agua destilada aproximadamente 2/3-3/4 del volumen real del medio preparado, agregue 40 g de sacarosa y revuelva para disolver. . Ajuste el pH a 5,8-6,0 con 0,5 mol L-1 NaOH y 0,5 mol L-1 HCl. Agregue 14 g de agar, coloque la olla de aluminio en la estufa eléctrica, revuelva y caliente para disolver completamente el agar, luego use agua destilada para llevar el volumen a un volumen final de 2 L, continúe calentando durante unos minutos para mezclar uniformemente y luego distribuir en matraces Erlenmeyer.
Inducción de callos en hojas de tabaco
Tome una placa de Petri estéril, corte 1-2 hojas de plántula estériles con un bisturí, colóquelas en la placa de Petri estéril y use la solución
Utilizar un cuchillo cortante para cortar las hojas en pequeños trozos de unos 2mm2, y luego inocularlas en el medio de cultivo preparado, inoculando cada botella.
Cinco trozos pequeños, uno* * *inocular 6 frascos.
Las Trichomonas inoculadas se cultivaron en 24 condiciones durante 65438 ± 0 semanas en la oscuridad y luego en las mismas condiciones.
Las muestras se cultivaron en luz y oscuridad total durante 3 semanas hasta la formación de callos (cada 3 botellas en este caso). .
Observe los resultados de la inducción de callos y calcule la tasa de inducción de callos.
Cultivo de diferenciación de órganos y regeneración de plantas
Transferir los callos inducidos a medio de diferenciación según su tipo y cultivo bajo luz continua y temperatura de 20-22°C durante 3 semanas, y el Se contó la regeneración de la planta callosa.
Descripción general de la inducción de callo
Después de 4 semanas de inducción y cultivo de callo de tabaco, básicamente se formó callo, lo que descartó que el callo fuera causado por un tiempo de crecimiento insuficiente.
No se formaron callos. Consulte la Tabla 1 para obtener más detalles. Se formaron callos en los seis matraces de cultivo, pero no se desarrolló ninguno.
Contaminación, pero la tasa de inducción es casi la misma. Entre ellos, la tasa promedio de inducción de callos de las tres botellas cultivadas en condiciones de luz fue de 100
60,0℅, y la tasa promedio de inducción de callos de las tres botellas cultivadas en condiciones de oscuridad fue de 46,7. Dado que en los explantes del experimento,
las hojas de tabaco eran demasiado pequeñas, la mayoría de las células de algunos de los explantes pueden haberse deshidratado y muerto durante la inoculación, lo que provocó que toda la planta
se Sea callo en este experimento. La tasa de inducción del tejido es baja y el callo es pequeño.
Medio también incluye: 1640 mediano.
Medios especiales:
Medios selectivos
1 medio de enriquecimiento de levadura
Glucosa 5 urea 0,1 sulfuro de amonio 0,1 dihidrógeno fosfato Potasio 0,25 Hidrógeno disódico fosfato 0,05 Sulfato de magnesio heptahidratado 0,1 Sulfato de hierro heptahidratado 0,01 Extracto de levadura 0,05.
Rojo de Bengala 0,003 pH 4,5
Cultivo de enriquecimiento de bacterias autótrofas fijadoras de nitrógeno en medio Ashby libre de nitrógeno
Manitol 1 dihidrógeno fosfato Potasio 0,02 Sulfato de magnesio heptahidratado 0,02 Cloruro de sodio 0,02
Sulfato de calcio dihidrato 0,01 Carbonato de calcio 0,5
Dos medios diferenciales
Medio de cultivo EMB, comúnmente utilizado para la identificación de Escherichia coli
Peptona 10 g lactosa 5 g sacarosa 5 g hidrogenofosfato dipotásico 2 g eosina Y 0,4 g azul de metileno 0,065 g
Agua destilada 1000 g pH7,2
Una fórmula media para aislar microorganismos marinos
Fórmula media 2216E (medio sólido)
5 g de peptona
1 g de lodo de levadura
0,01 g de fosfato de hierro
15-20 g agar
1000ml de agua de mar vieja
Hervir la solución de hidróxido de sodio (5) para ajustar el valor del pH a 7,6 -7,8.
Otros medios:
1. Alto primer medio
KNO3: 1g,
Cloruro de sodio: 0,5g,
Dihidrogenofosfato potásico: 0,5g
Sulfato magnésico·7H2O: 0,5g
Sulfato ferroso heptahidrato: 0,01g
Solubilidad 20g almidón
20g de agar
1000 ml de agua destilada
Ajustar el pH a 7,2 ~ 7,4 y esterilizar a 121°C durante 30 minutos.
Método: Primero mezcle el almidón con una pequeña cantidad de agua hasta formar una pasta, luego ponga 700 ml de agua en la estufa eléctrica y caliéntela hasta que hierva.
A continuación vierte la pasta de almidón sin dejar de remover, manteniendo la ebullición, y luego añade el resto de ingredientes.
Después de disolver añadir agua hasta 1000 ml.
Caldo peptona inclinado:
10g peptona
5g pasta de ternera
1000 ml agua destilada
Sodio clorado : 5 gramos
Ph: 7,0 ~ 7,2, esterilizado a 121°C durante 20 minutos.
Si la preparación de un medio de cultivo sólido requiere agar 1,5~2, se puede añadir agar 0,5~0,8 al medio de cultivo semisólido.
Diferentes medios de cultivo celular
Medios de cultivo celular naturales
El medio de cultivo natural se refiere a un tipo de medio de cultivo derivado de fluidos corporales animales o extraído mediante separación de tejidos. como plasma, suero, linfa, extracto de embrión de pollo, etc. En los primeros días de la tecnología de cultivo de tejidos, se utilizaban medios naturales para el cultivo de células in vitro. Sin embargo, debido al complejo proceso de producción y a las grandes diferencias entre lotes, los medios naturales son reemplazados gradualmente por medios sintéticos. El medio de cultivo natural más utilizado actualmente es el suero. En el cultivo de algunas células especiales también son esenciales diversos extractos de tejido y sustancias de colágeno que favorecen la adhesión celular.
Tipo de suero
El suero utilizado actualmente para el cultivo de tejidos es principalmente suero bovino, y algunas células especiales también se cultivan con suero humano, suero de caballo, etc. Las razones para elegir suero bovino para el cultivo celular son: fuentes suficientes, tecnología de preparación madura y una comprensión más profunda de la misma después de pruebas de aplicación a largo plazo. El suero bovino es adecuado para la mayoría de células de mamíferos, pero no se descarta que el uso de otros sueros animales sea más adecuado a la hora de cultivar determinadas células.
El suero bovino es el medio natural más utilizado en el cultivo celular, es rico en nutrientes necesarios para el crecimiento celular y tiene funciones sumamente importantes. El suero bovino se puede dividir en suero de ternera, suero de ternera recién nacido y suero de ternera fetal. El suero bovino fetal debe obtenerse de fetos de vaca mediante cesárea. El suero de ternera recién nacido se extrae de terneros recién nacidos dentro de las 24 horas posteriores al nacimiento; el suero de ternera se extrae de terneros nacidos entre 10 y 30 días de edad. Obviamente, la calidad del suero fetal bovino es la más alta, porque los fetos bovinos no han estado expuestos al mundo exterior y el suero contiene la menor cantidad de anticuerpos, complementos y otros componentes dañinos para las células.
Principales componentes del suero
El suero es una mezcla muy compleja formada por la eliminación de la fibrina del plasma. Aunque se conocen la mayoría de sus componentes, algunos aún se desconocen. Los componentes y el contenido del suero suelen variar según el sexo, la edad, la condición fisiológica y el estado nutricional del donante de sangre. El suero contiene diversas proteínas plasmáticas, péptidos, grasas, carbohidratos, factores de crecimiento, hormonas, sustancias inorgánicas, etc. , están en equilibrio fisiológico en términos de promover el crecimiento celular o inhibir la actividad de crecimiento.
Las principales funciones del suero
1. Aportar nutrientes básicos: aminoácidos, vitaminas, sustancias inorgánicas, sustancias lipídicas, derivados de ácidos nucleicos, etc. , es una sustancia esencial para el crecimiento celular.
2. Aportan hormonas y diversos factores de crecimiento: insulina, hormonas adrenocorticales (hidrocortisona, dexametasona), hormonas esteroides (estradiol, testosterona, progesterona), etc. Factores de crecimiento, como el factor de crecimiento de fibroblastos, el factor de crecimiento epidérmico, el factor de crecimiento de plaquetas, etc.
3. Aportar proteínas de unión: Las proteínas de unión se utilizan para transportar sustancias importantes de bajo peso molecular, como la albúmina para transportar vitaminas, grasas y hormonas, y la transferrina para transportar hierro. Las proteínas de unión juegan un papel importante en el metabolismo celular.
4. Proporcionar factores de promoción del contacto y de estiramiento para evitar la adhesión celular por daño mecánico.
5. Tiene un cierto efecto protector sobre las células en cultivo: algunas células, como las células endoteliales, las células mieloides, etc., pueden liberar proteasas y el suero contiene componentes antiproteasas, que tienen un efecto protector. efecto neutralizante. Este efecto se descubrió accidentalmente y ahora el suero se utiliza específicamente para bloquear la digestión de tripsina. Porque la tripsina se ha utilizado ampliamente para la digestión y el paso de células adherentes. Las proteínas séricas forman la viscosidad del suero y protegen las células del daño mecánico. Especialmente en cultivos en suspensión, la viscosidad juega un papel importante. El suero también contiene algunos oligoelementos e iones que desempeñan un papel importante en el metabolismo y la desintoxicación, como el SeO3 y el selenio.
Principales problemas con los medios de cultivo de suero
1. Puede haber cientos de componentes del suero, pero la composición exacta, el contenido y el mecanismo de acción aún no están claros, especialmente algunos factores de crecimiento polipeptídicos. Las hormonas y los lípidos no se comprenden completamente, lo que plantea muchas dificultades al trabajo de investigación.
2. El suero se produce en lotes y varía mucho entre lotes. La vida útil del suero es de un año como máximo. Por tanto, es extremadamente difícil asegurar la similitud de cada lote de suero, lo que limita la estandarización y continuidad de los experimentos.
3. Para la mayoría de las células, el suero no es el fluido fisiológico con el que entran en contacto en el cuerpo, sino sólo durante el proceso de curación de lesiones y coagulación de la sangre, por lo que el uso de suero puede cambiar la función de ciertas células. en el cuerpo En condiciones normales, el suero puede promover el crecimiento de ciertas células (fibroblastos) e inhibir el crecimiento de otro tipo de células (células epidérmicas).
4. El suero contiene algunas sustancias que son tóxicas para las células, como la poliaminooxidasa, que puede reaccionar con poliaminas (como la espermina y la espermidina) producidas por células altamente proliferantes para formar sustancias citotóxicas. . El complemento, los anticuerpos y las toxinas bacterianas pueden afectar el crecimiento celular e incluso provocar la muerte celular.
5. Las fuentes y los números de lote de suero de diferentes animales son diferentes. La calidad de cada lote varía mucho y sus ingredientes no pueden ser consistentes.
6. Se pueden introducir micoplasmas y virus en la muestra, afectando potencialmente a las células, lo que puede provocar fallos experimentales o resultados experimentales poco fiables.
7. En la producción a gran escala, la fuente de suero es cada vez más difícil y costosa, lo que constituye una de las partes principales de los costos de producción de cultivos de células animales.
Estándares de calidad del suero
La calidad del suero depende de dos factores: uno es el objeto de muestreo y el otro es el proceso de muestreo. Los animales utilizados para el muestreo deben estar sanos y libres de enfermedades y dentro de la fecha de nacimiento especificada. El proceso de muestreo debe realizarse en estricta conformidad con los procedimientos operativos y el suero preparado debe someterse a una estricta identificación de calidad. Los requisitos del “Reglamento sobre Producción de Productos Biológicos mediante Cultivo de Células Animales in Vitro” promulgado por la OMS:
1. encefalopatía espongiforme y debe contar con un sistema de seguimiento adecuado.
2.Algunos países también exigen que el suero bovino provenga de ganado que nunca haya utilizado piensos proteicos para rumiantes.
3. Acreditar que el suero bovino utilizado no contiene inhibidores del virus vacunal producido.
4. El suero debe esterilizarse con una membrana filtrante para garantizar la esterilidad.
5. Sin contaminación por bacterias, moho, micoplasmas y virus, algunos países no exigen contaminación por fagos.
6. Tiene un buen efecto de apoyo a la reproducción celular.
En la versión de 2000 de las "Normas de control de calidad de China para las principales materias primas y excipientes de productos biológicos", mi país ha propuesto normas estrictas para la calidad del suero bovino, incluido el contenido de proteínas, bacterias, hongos, micoplasma, virus bovinos y Escherichia coli. Bacteriófagos, endotoxinas bacterianas y examen de proliferación celular de apoyo.