Análisis de las desventajas de la tecnología de visualización de fagos
(1) Durante el proceso de presentación en fagos, se requiere transformación bacteriana y empaquetamiento de fagos, y algunos sistemas de presentación también se someten a un proceso de secreción transmembrana, lo que limita en gran medida la capacidad y la diversidad molecular de la biblioteca construida. El número de moléculas que contienen diferentes secuencias en las bibliotecas de presentación en fagos comúnmente utilizadas está generalmente limitado a 109.
(2) No todas las secuencias pueden expresarse bien en fagos, porque la realización de algunas funciones proteicas requiere plegamiento, transporte, inserción de membrana y formación de complejos, lo que resulta en la necesidad de una selección adicional durante la detección de presión in vivo. . Por ejemplo, en los experimentos de bibliotecas de presentación en fagos, debido a que las proteínas parcialmente desplegadas se degradan fácilmente en las bacterias, las condiciones deben controlarse cuidadosamente para garantizar que las bibliotecas presentadas en la superficie del fago no se degraden. Además, la mala expresión de anticuerpos murinos en fagos también es un ejemplo de presión selectiva in vivo. Las proteínas eucariotas se expresan pobremente en bacterias porque su síntesis de proteínas y sus mecanismos de plegamiento son diferentes [15].
(3) Una vez construida una biblioteca de presentación de fagos, es difícil llevar a cabo una mutación y recombinación in vitro efectivas, lo que limita la diversidad genética molecular en la biblioteca.
(4) Dado que el sistema de presentación en fagos se basa en la expresión de genes intracelulares, es difícil expresar y mostrar eficazmente algunas moléculas que son tóxicas para las células, como las moléculas de biotoxina.
Tecnología de visualización de fagos (editado por motion_xu)
La determinación del epítopo antigénico, incluida la secuencia y la conformación del epítopo, es una cuestión de interés para los inmunólogos. La determinación de epítopos no sólo permite aprender mucha información sobre la respuesta inmunitaria y sentar las bases para un mayor control artificial de la respuesta inmunitaria, sino que también tiene una importancia orientadora para la síntesis de fármacos, el diseño de vacunas, etc. Los métodos comúnmente utilizados para determinar epítopos incluyen: método de reducción, método de transferencia Western, escaneo de péptidos, análisis de mutaciones, etc. Los dos últimos métodos también resuelven el problema de la secuencia primaria de moléculas de proteínas. Pero la mayoría de estos métodos son difíciles y engorrosos.
En los últimos años, la tecnología de presentación en fagos se ha convertido en una herramienta útil para detectar la estructura espacial de las proteínas, explorar los sitios de unión de interacción entre receptores y ligandos, y buscar moléculas de ligandos biológicamente activas y de alta afinidad. ha tenido un profundo impacto en campos de investigación como el estudio del reconocimiento mutuo molecular, el desarrollo de nuevas vacunas y el tratamiento de tumores. La aplicación de bibliotecas de péptidos proporciona otra herramienta poderosa para determinar secuencias de epítopos e incluso sus conformaciones.
La biblioteca de péptidos de presentación de fagos utiliza el gen de la proteína de cubierta del fago PⅢ o PⅧ como portador, insertando un fragmento de gen que codifica un péptido corto exógeno. La infectividad del fago no se ve afectada y el péptido corto exógeno sí puede. También se puede utilizar en El extremo N de la proteína PIII o PVIII en la superficie del fago forma una cierta conformación espacial. En 1990, Scott fusionó un péptido corto aleatorio con la proteína de superficie PIII de un fago filamentoso y lo mostró en la superficie del fago, estableciendo la primera biblioteca de péptidos aleatorios de fagos.
El principio básico de la detección de epítopos a partir de bibliotecas de péptidos aleatorios de presentación de fagos es la biopanning. Tomando como ejemplo la detección de epítopos de proteínas con anticuerpos monoclonales, el proceso técnico básico es el siguiente: después de recubrir el anticuerpo monoclonal en una placa de polietileno, se agrega la biblioteca de péptidos de presentación en fagos para permitir que reaccione completamente con el anticuerpo monoclonal, y luego, el péptido libre no unido se elimina por lavado y luego se utiliza el eluyente para eluir el fago unido. El huésped Escherichia coli se amplificó y recuperó, y luego se llevó a cabo la siguiente ronda de detección. Generalmente después de 3 o 4 rondas de cribado, y aumentando cada vez la intensidad del cribado, se pueden obtener clones de fagos que se unen más estrechamente al anticuerpo monoclonal. Mediante la determinación y el análisis de la secuencia, se puede inferir la secuencia del péptido corto extraño transportado por el clon del fago, determinando así el epítopo al que se dirige el anticuerpo monoclonal.
Con la ayuda de la tecnología de biblioteca de péptidos de presentación en fagos, se han analizado con éxito los epítopos de varios antígenos proteicos, como el VIH (Keller et al., 1993; Du Yong et al., 2000), el VHB, HCV (Du Yong et al., 2000) et al., 1999; Francesca et al., 2001; Pan Wei et al., 2001), Schistosoma japonicum (Ouyang Li et al., 2002), etc., lo que indica que Las bibliotecas de péptidos se pueden utilizar para identificar epítopos lineales y conformacionales de antígenos, lo que simplifica enormemente la inmunización recombinante. Los procesos originales de clonación, identificación y expresión han agregado nuevos métodos a la investigación de identificación de epítopos.
Los fagos filamentosos son inmunogénicos y pueden producir anticuerpos sin adyuvantes, lo que significa que los sistemas de presentación en fagos pueden usarse como herramienta para la presentación de epítopos candidatos a vacunas.
Los ratones se inmunizaron directamente con fagos que mostraban el epítopo neutralizante de Clostridium botulinum sin adyuvante. La prueba ELISA en suero mostró que el valor de DO de los ratones inmunizados era de 2 a 10 veces mayor que el de los ratones de control. Muestra que el epítopo mostrado por el fago tiene una antigenicidad obvia.
Ventajas de la tecnología de presentación en fagos Como método y herramienta de investigación emergente, la tecnología de presentación en fagos se ha utilizado ampliamente en el estudio de la estructura de las proteínas. Tiene muchas ventajas significativas, como:
A. La selección de alto rendimiento inmoviliza las moléculas objetivo (anticuerpos) en portadores de fase sólida y agrega bibliotecas de péptidos de presentación de fagos (la cantidad de fagos puede alcanzar 1011 PFU). usar la afinidad específica del antígeno-anticuerpo para adsorber el fago que se une al anticuerpo en el portador de fase sólida. El fago que no puede unirse todavía está en la solución y puede eliminarse mediante lavado, y luego se eluye el fago específicamente unido. y esto se repite varias veces. Mediante rondas de amplificación y análisis, se pueden aislar genes útiles de más de un millón de clones de fagos.
B. Puede usarse para detectar mimotopos. Hay muchos informes sobre el uso de tecnología de presentación de fagos para obtener mimotopos (Giuseppe, 2001; Seshi et al., 2002; Ouyang et al., 2003). Li Quanxi et al. (1997) utilizaron el anticuerpo monoclonal 9E10 para seleccionar una biblioteca de péptidos aleatorios de fagos y obtuvieron dos clones positivos, uno de los cuales era homólogo a la secuencia natural del antígeno, mientras que el otro era completamente diferente (es decir, un mimotopo). ). Los epítopos imitadores también pueden inducir respuestas inmunes específicas similares a los epítopos naturales. Por ejemplo, la inmunización de ratones con epítopos imitadores del virus de la hepatitis B puede inducir la producción de títulos elevados de anticuerpos contra el virus de la hepatitis B.
C. Fago recombinante fácil de purificar. Los pasos de purificación son simples, no requieren reactivos ni equipos costosos y se pueden completar en condiciones generales de laboratorio. El vector fago utilizado para identificar epítopos y receptores fue 13 fagos monocatenarios. Dado que el fago M13 es un fago suave y no lisa las bacterias huésped, los fagos maduros se pueden secretar en el medio de cultivo. El sobrenadante del cultivo se recoge mediante centrifugación y luego se le agrega un precipitante para precipitar una gran cantidad de partículas de fagos en el. Se recogen el sobrenadante, enriqueciendo así los fagos recombinantes que contienen productos de genes extraños.
A pesar de esto, todavía existen algunas deficiencias en la tecnología de visualización en fagos. En primer lugar, la capacidad de la biblioteca de péptidos construida solo puede llegar a 109, y es difícil construir una biblioteca de péptidos de fragmentos grandes. En segundo lugar, es necesario resolver el problema de la diversidad de las bibliotecas de péptidos. En tercer lugar, una pequeña cantidad de péptidos no pueden exhibirse en la superficie del fago porque son demasiado hidrofóbicos o afectan el plegamiento de las proteínas de la membrana externa. Como nueva tecnología, existen muchos problemas específicos similares. Pero estas deficiencias temporales no pueden ocultar su enorme potencial de aplicación.