Cómo se suelen esterilizar los medios de cultivo, los recipientes de cultivo y los materiales vegetales

Los métodos de esterilización comúnmente utilizados se pueden dividir en dos categorías: físicos y químicos, a saber: métodos físicos como calor seco (hornear y quemar), calor húmedo (cocción a presión normal o alta presión), tratamiento con radiación ( Ultravioleta, ultrasónico, microondas), filtración, limpieza y lavado con grandes cantidades de agua esterilizada y otras medidas químicas son el uso de cloruro de mercurio, formaldehído, peróxido de hidrógeno, permanganato de potasio, lisol, polvo blanqueador, hipoclorito de sodio, antibióticos, productos químicos alcohólicos; tratar con. Estos métodos y agentes deben seleccionarse adecuadamente según los diferentes materiales y propósitos utilizados en el trabajo.

1. Esterilizar el medio de cultivo con calor húmedo.

El proceso de esterilización del medio de cultivo debe completarse dentro de las 24 horas posteriores a su preparación. El principio de la esterilización a alta presión es: en una vaporera sellada, el vapor no puede escapar y la presión continúa aumentando, lo que hace que el punto de ebullición del agua aumente continuamente y la temperatura dentro de la olla también aumenta. Bajo una presión de 0,1 mpa, la temperatura en el recipiente alcanza los 121°C. A esta temperatura del vapor se pueden matar rápidamente diversas bacterias y sus esporas altamente resistentes al calor.

Tenga cuidado de eliminar completamente el aire de la olla para que toda la olla se llene de vapor de agua, para que la esterilización pueda ser completa. Hay varias formas diferentes de desinflar la esterilización a alta presión, pero el propósito es eliminar el aire, calentar la olla de manera uniforme y garantizar una esterilización completa. El método común es: cerrar la válvula de purga. Después de encender, cuando la presión aumente a 0,05 mpa, abra la válvula de purga para liberar el aire. Después de que el puntero del manómetro vuelva a cero, cierre la válvula de purga nuevamente.

Después de cerrar la válvula y volver a encender la alimentación, cuando el manómetro suba a 0,1 mpa, comience a cronometrar y mantenga la presión en 0,1-0,15 mpa durante 20 minutos.

El tiempo de mantenimiento de la presión varía en función del tamaño del recipiente. Ver Tabla 1. Los números que aparecen en esta tabla son números seguros para una esterilización completa. Si el recipiente es grande pero la cantidad colocada es pequeña, el tiempo también se puede reducir.

Tabla 1. Tiempo mínimo necesario para la esterilización con vapor a alta presión de medios de cultivo

Volumen del recipiente/ml

Tiempo mínimo necesario para la esterilización a 121°C / min

20-50

15

75-150

20

250-500

25

1000

30

Después de alcanzar el tiempo de mantenimiento de la presión, se puede cortar la energía cuando la presión alcanza 0,5 mpa. , el vapor puede liberarse lentamente. Se debe tener cuidado de no reducir la presión demasiado rápido, provocando una intensa ebullición por descompresión y provocando que el líquido del recipiente se desborde. Cuando la presión cae a cero, se puede abrir la tapa, sacar el medio y colocarlo en la plataforma para esperar la condensación. No deje que el aire se desinfle durante mucho tiempo, lo que provocará que la composición del medio cambie, de modo que el medio no se pueda inclinar. Una vez que se deja por mucho tiempo, la tapa no se puede abrir debido a la presión negativa en la caldera. Mientras se abra la válvula de purga, entre la presión atmosférica y las presiones interna y externa estén equilibradas, la tapa se abrirá fácilmente. abierto.

Para artículos que no se deteriorarán después de la esterilización a alta presión, como agua esterilizada, medios de cultivo y herramientas de inoculación, se puede extender el tiempo de esterilización o aumentar la presión. El medio de cultivo debe cumplir estrictamente con el tiempo de mantenimiento de la presión. No solo debe mantener la presión a fondo, sino también evitar que los componentes del medio de cultivo se deterioren o reduzcan su eficacia.

Algunos productos de tela, como batas de laboratorio, mascarillas, etc., también pueden esterilizarse mediante alta presión. Después de lavarlos y secarlos, colóquelos en bolsas de plástico resistentes a alta presión y esterilice en autoclave durante 20 a 30 minutos.

El valor del pH del medio de cultivo antes y después del autoclave cayó entre 0,2 y 0,3 unidades. La dirección y amplitud de los cambios en el valor del pH del medio de cultivo después de una alta presión dependen de muchos factores. Cuando el medio tiene un solo componente o cuando el medio contiene concentraciones altas o relativamente altas de sustancias, el valor del pH después del tratamiento en autoclave cambia mucho, pudiendo incluso ser superior a 2 unidades de pH. Los cambios en el pH ambiental superiores a 0,5 unidades pueden tener efectos fisiológicos significativos.

El autoclave normalmente hidroliza la sacarosa del medio de cultivo en azúcares simples, cambiando así la presión osmótica del medio de cultivo. En el intervalo de 8-20 sacarosa, el medio de cultivo después del tratamiento en autoclave aumentó aproximadamente 0,43 veces.

El hierro en el medio de cultivo catalizará la hidrólisis de la sacarosa durante el autoclave, que puede hidrolizar entre el 15 y el 25 % de la sacarosa en glucosa y fructosa.

Si el valor del medio de cultivo es inferior a 5,5, la cantidad de hidrólisis es mayor. Cuando se añaden 0,1 carbón activado al medio de cultivo, la hidrólisis de sacarosa a alta presión mejora considerablemente. La tasa de hidrólisis de sacarosa puede llegar a 5.

Para evitar los cambios mencionados anteriormente causados ​​por la esterilización a alta presión, se pueden utilizar los siguientes métodos:

(1) Siempre preste atención a la recopilación de información sobre el impacto de la esterilización a alta presión. esterilización a presión sobre la composición del medio de cultivo, para que se puedan tomar medidas efectivas de manera oportuna.

(2) Al diseñar la fórmula del medio de cultivo, intente utilizar reactivos estables con efectos similares y controle con precisión la dosis. Por ejemplo, evite el uso de fructosa y sorbitol y use manitol, reemplace IAA con IBA, controle la cantidad de carbón activado (por debajo de 0,1) y preste atención al impacto del valor del pH en los componentes del medio de cultivo en autoclave.

(3) Al preparar el medio de cultivo, se debe prestar atención a la agrupación adecuada de ingredientes y al orden en que se añaden. Por ejemplo, agregue fósforo, calcio y hierro al final.

(4) Preste atención a los cambios y la dinámica de recuperación del valor de pH del medio de cultivo después del autoclave. Por ejemplo, el valor del pH después del tratamiento en autoclave suele aumentar de 5,8 a 6,48. Caerá a alrededor de 5,8 después de 96 horas. De esta manera, esta regla se puede dominar en experimentos.

2. Los instrumentos utilizados para operaciones asépticas deben esterilizarse quemándolos.

Durante las operaciones asépticas, sumerja las pinzas, tijeras, bisturíes, etc. en alcohol al 95% antes de usarlos. y esterilizarlo quemándolo sobre la llama de una lámpara de alcohol. Después de enfriar, utilizar inmediatamente. Durante la operación se puede utilizar una botella de boca ancha de 250 o 500 ml y se puede poner alcohol al 95% para facilitar la inserción de la herramienta.

3. Esterilización por calor seco de cristalería y utensilios resistentes al calor.

La esterilización por calor seco utiliza un horno para calentar a una temperatura de 160-180 °C para matar los microorganismos. Dado que en condiciones de calor seco, la resistencia al calor de las células vegetativas bacterianas mejora considerablemente, acercándose al nivel de resistencia al calor de las esporas, la esterilización normalmente se lleva a cabo a 170°C durante 90 minutos. Los artículos que se van a esterilizar con calor seco deben lavarse y secarse con anticipación, y las herramientas y otras herramientas deben envolverse adecuadamente para evitar una nueva contaminación cuando se saquen después de la esterilización. El vendaje puede estar fabricado de plástico resistente a altas temperaturas. Durante la esterilización, la temperatura debe elevarse gradualmente y se debe registrar el tiempo después de alcanzar la temperatura predeterminada. La cantidad de artículos colocados en el horno no debe ser demasiado grande para no obstaculizar la convección y penetración del calor. Después de apagar la alimentación a la hora especificada, el horno sólo se puede abrir después de que se haya enfriado lo suficiente para evitar roturas. de los utensilios debido a un enfriamiento repentino. La esterilización por calor seco consume demasiada energía y es una pérdida de tiempo.

4. Las sustancias termolábiles deben esterilizarse mediante filtración.

Algunos reguladores del crecimiento, como la giberelina, la zeatina, el ácido abscísico y ciertos microorganismos, no se pueden esterilizar en autoclave. y normalmente se utiliza la esterilización por filtro.

Algunos componentes químicos se degradarán bajo altas temperaturas y presiones y perderán su efectividad o reducirán su efectividad. La actividad de la giberelina GA3 después de la esterilización a alta temperatura es solo 10 veces mayor que la de la solución fresca sin esterilización a alta temperatura. La sacarosa se degrada parcialmente en d-glucosa y d-fructosa después de altas temperaturas, y la fructosa se puede hidrolizar parcialmente para producir sustancias que inhiben el crecimiento de tejidos vegetales cultivados. Las altas temperaturas también hacen que reaccionen los carbohidratos y los aminoácidos. Las vitaminas tienen distintos grados de estabilidad térmica, pero si el pH del medio de cultivo es superior a 5,5, la vitamina B1 se degradará rápidamente. El pantotenato de calcio, los extractos de tejidos vegetales, etc. deben filtrarse y esterilizarse, no esterilizarse a alta temperatura, de lo contrario perderán su efecto.

El diámetro de la malla de la membrana del filtro antibacteriano es inferior a 0,45 micras. Cuando la solución pasa a través del filtrado, las células bacterianas y las esporas de hongos se bloquean porque son más grandes que el diámetro del filtro. membrana cuando se requiere filtración y esterilización, cuando el volumen de líquido es grande, a menudo se usa un dispositivo de filtración por succión; cuando el volumen de líquido es pequeño, se puede usar una jeringa; Esterilice en autoclave antes de su uso, instale la membrana del filtro cerca del tubo de la aguja de la jeringa, coloque el líquido a filtrar en la jeringa, empuje el vástago del pistón de la jeringa, la solución sale de la membrana del filtro y la solución se exprime de la aguja. El tubo es la solución estéril.

Pasos de la operación de esterilización por filtración: Primero, envuelva el filtro y la botella que contiene líquido con papel. La membrana del filtro se puede colocar en la placa de Petri y envolver con papel. Antes de usarlo, esterilícelo con vapor a alta presión a 121 °C durante 30 minutos; instale el dispositivo de filtrado en la mesa de trabajo ultralimpia, use pinzas sin dientes esterilizadas para colocar la membrana del filtro en la partición, con el lado rugoso de la membrana del filtro. mirando hacia arriba; luego coloque el dispositivo de filtrado. El líquido esterilizado se inyecta en el filtro y se enciende la bomba de vacío para filtrar y esterilizar. El filtrado se puede almacenar para su uso posterior después de haber demostrado un crecimiento estéril mediante cultivo.

5. Utilizar rayos ultravioleta y fumigación para esterilizar el espacio.

(1) La esterilización ultravioleta se realiza en la sala de inoculación, mesa ultralimpia o caja de inoculación mediante lámparas ultravioleta. La esterilización ultravioleta utiliza factores de radiación para esterilizar. Después de que las bacterias absorben la luz ultravioleta, la estructura de las proteínas y los ácidos nucleicos sufre cambios estructurales que provocan mutaciones cromosómicas bacterianas y la muerte. La longitud de onda de la luz ultravioleta es de 200 a 300 nm, de los cuales 260 nm tiene la mayor capacidad de esterilización. Sin embargo, debido a que la capacidad de penetración de la luz ultravioleta es muy débil, solo es adecuada para esterilizar aire y superficies de objetos, y no es necesario. a más de 1,2 metros de distancia del objeto de irradiación.

(2) La fumigación y la esterilización utilizan calentamiento, incineración, oxidación y otros métodos para convertir los químicos en estado gaseoso y difundirlos en el aire para matar los microorganismos en el aire y en la superficie de los objetos. Este método es sencillo y sólo requiere cerrar herméticamente el espacio desinfectado.

Existen muchos tipos de desinfectantes químicos que desnaturalizan las proteínas de los microorganismos, compiten por sus sistemas enzimáticos o reducen su tensión superficial, aumentan la permeabilidad de la membrana plasmática de las células bacterianas y provocan la ruptura de las células. o disolver. En términos generales, cuanto mayor sea la temperatura, mayor será el tiempo de acción y mejor será el efecto de esterilización. Además, dado que el desinfectante debe disolverse en agua para que sea eficaz, debe convertirse en un estado soluble en agua, como el cloruro de mercurio y el permanganato de potasio. Además, la concentración de los desinfectantes generalmente significa que cuanto mayor sea la concentración, mayor será su capacidad bactericida, con excepción del ácido carbólico y el alcohol.

El fumigante comúnmente utilizado es formaldehído. Durante la fumigación se debe cerrar herméticamente la habitación según la dosis de 5-8ml/m3, se coloca formaldehído en un recipiente de boca ancha y 5g/m3 de potasio. Se agrega permanganato para oxidar y evaporar. Al fumigar, se puede rociar previamente la habitación para potenciar el efecto. El ácido acético glacial también se puede utilizar para calentar y fumigar, pero no es tan eficaz como el formaldehído.

6. Utilice productos químicos para esterilizar con spray las superficies de algunos objetos.

Algunos productos químicos se pueden aplicar a las superficies de los objetos y rociarlos para esterilizarlos. Por ejemplo, las mesas, las paredes, las manos, las superficies de material vegetal, etc. se pueden esterilizar aplicando repetidamente alcohol al 75 %, 1-2 solución de Lysol y 0,25-1 solución de clormetionina.

7. Esterilizar la superficie de los materiales vegetales con desinfectantes

Los materiales vegetales seleccionados del exterior o del interior contienen diversos microorganismos en distintos grados. Una vez que estas fuentes de contaminación se introducen en el medio de cultivo, provocarán la contaminación del medio de cultivo. Por lo tanto, los materiales vegetales deben someterse a una estricta esterilización de la superficie y luego ser inoculados en el medio de cultivo mediante procedimientos asépticos. Este proceso se denomina inoculación. El material vegetal inoculado se denomina explante.

El agente antibacteriano de cultivo de tejidos vegetales (PPM) representado por Qiwei Yicheng es un agente antimicrobiano de amplio espectro que puede matar células bacterianas y fúngicas, prevenir la germinación de esporas de hongos y, en concentraciones más altas, puede eliminar la contaminación endógena. de explantes.

En primer lugar, retire las partes no utilizadas de los materiales vegetales recogidos y lave cuidadosamente las partes necesarias, como frotando con un cepillo adecuado. Corte los materiales en tamaños adecuados que quepan en el recipiente de esterilización. Deje correr el grifo con agua corriente y enjuague durante unos minutos a unas horas. El tiempo de enjuague depende de la limpieza del material. Los materiales que flotan fácilmente o que son pequeños se pueden lavar en bolsas de gasa. Enjuagar con agua corriente es particularmente útil cuando la contaminación es grave.

Al lavar, puede agregar detergente en polvo para limpiar y luego enjuagar el agua en polvo con agua del grifo. El polvo de lavandería puede eliminar la suciedad ligeramente adherida a la superficie de las plantas, eliminar sustancias lipídicas y facilitar el contacto directo con la solución esterilizante. Por supuesto, el material de limpieza más ideal es el tensioactivo Tween.

El segundo paso es infiltrar y esterilizar la superficie del material. Se debe realizar sobre una mesa o caja de inoculación limpia. Preparar vasos de precipitados esterilizados, varillas de vidrio, alcohol 70, desinfectante, agua esterilizada, relojes, etc. Remojar en alcohol al 70% durante 10 a 30 segundos. Dado que el alcohol tiene el efecto de empapar la superficie de los materiales vegetales, y el alcohol al 70% tiene un fuerte poder de penetración y puede matar fácilmente las células vegetales, el tiempo de infiltración no puede ser demasiado largo. Hay algunos materiales especiales, como frutas, capullos de flores, botas envueltas con brácteas, hojas de brácteas, etc., cogollos latentes con múltiples capas de escamas, etc., y materiales que se usan principalmente internamente, solo puedes usar alcohol 70 para un tiempo un poco más largo. El material tratado se coloca en condiciones estériles y luego se retira la capa exterior después de que el alcohol se evapora y se accede al material interior.

El tercer paso es tratar con esterilizante. Hay muchos tipos de esterilizantes de superficie y se pueden seleccionar 1 o 2 para su uso según la situación (Tabla 2).

Tabla 2. Comparación de concentraciones y efectos de esterilizantes de uso común

Nombre del esterilizador

Concentración

Tiempo de esterilización/min

Efecto de esterilización

Alcohol

70-75

0,1-3

Bueno

Mercúrico cloruro

0,1-0,2

2-10

Muy bien

Polvo blanqueador

Solución saturada

5-30

Muy bien

Hipoclorito de calcio

9-10

5-30

Muy bien

Hipoclorito de sodio

2

5-30

Muy bien

Peróxido de hidrógeno

10-12

5-15

Bueno

Antibióticos

4-50 mg/L

30-60

Mejor

Los esterilizantes anteriores deben prepararse temporalmente antes de su uso y el cloruro de mercurio se puede almacenar para uso a corto plazo. Tanto el hipoclorito de sodio como el hipoclorito de calcio utilizan la descomposición para producir cloro para la esterilización, por lo que es mejor cubrirlo con una botella de boca ancha durante la esterilización; el cloruro de mercurio utiliza iones de mercurio de metales pesados ​​para lograr la esterilización. El peróxido de hidrógeno libera átomos durante la descomposición; En estado de oxígeno, el impacto residual de este agente es pequeño. Después de la esterilización, se puede enjuagar con agua esterilizada 3-4 veces. Dado que los materiales esterilizados con líquido de cloruro de mercurio son difíciles de eliminar el veneno residual del cloruro de mercurio, deben esterilizarse. con agua esterilizada. Enjuague con agua bacteriana de 8 a 10 veces, no menos de 3 minutos cada vez, para eliminar los virus residuales tanto como sea posible.

A la hora de esterilizar, transfiera el material vegetal sin escurrir a un vaso de precipitados u otro recipiente, marque el tiempo, vierta la solución desinfectante y revuelva suavemente con una varilla de vidrio de vez en cuando para favorecer la esterilización de cada parte de El contacto total con la solución elimina las burbujas y garantiza una desinfección completa. 1-2 minutos antes de que se acabe el tiempo, comience a verter el desinfectante en un vaso de precipitados grande preparado. Tenga cuidado de no derramar el material. Después de verterlo limpio, vierta agua esterilizada inmediatamente, revuelva suavemente y enjuague. El tiempo de esterilización comienza desde el momento en que se vierte el desinfectante y finaliza cuando se vierte el agua esterilizada. El tiempo de registro también facilita la comparación de los efectos de la desinfección y la realización de correcciones. La solución esterilizante debe sumergir completamente el material. Es mejor utilizar más líquido esterilizante que esterilizar muchos materiales en un recipiente pequeño.

Es mejor añadir Tween-80 o triton X a la solución de esterilización. La función principal de estos tensioactivos es facilitar que el agente se extienda y penetre en la superficie del material esterilizado. Sin embargo, el daño al material también aumenta después de agregar Tween. Preste atención a la cantidad de Tween y al tiempo de esterilización. Generalmente se agrega 0,5% de la solución de esterilización, es decir, se agregan 15 gotas por cada 100 ml.

El último paso es enjuagar con agua esterilizada, lo que dura unos 3 minutos y unas 3-10 veces dependiendo del tipo de desinfectante utilizado. La función de enjuague con agua esterilizada elimina los efectos secundarios de los desinfectantes que matan las células vegetales.